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在低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)发生发展过程中,低氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction, HPV)和肺血管重建是其两个主要病理生理学特征。肺血管重建是肺动脉高压持续存在且难以治疗的关键原因,肺动脉中膜平滑肌细胞的异常增生为肺血管壁重建的一个主要病理表现。随着对HPH发生机理的研究深入,抑制或逆转肺血管重建已成为防治HPH及其并发症的主要目标,但目前尚缺乏特异性治疗措施。我们实验室之前的研究显示丹参酮IIA磺酸钠(sodium tanshinoneIIA sulphonate, STS)可抑制低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterialsmooth muscle cell, PASMC)增殖,防止肺小动脉重塑,但其机制仍未阐明。细胞增殖与细胞增殖周期有关,细胞增殖周期受细胞周期蛋白(cyclin)及其依赖蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)和CDK抑制物(cyclin-dependent kinase inhibitor, CDKI)的共同调控。p27是抑制细胞增殖的重要因子之一。目前已有研究结果显示HPH时p27是肺动脉平滑肌细胞中唯一表达量显著减少的CDKI,上调p27可抑制PASMC增殖。因此,增加p27的表达将有利于抑制肺血管结构重建,防治肺动脉压过度增高,改善HPH病人的预后。S期蛋白相关激酶2(S phase kinase associated protein 2,Skp2)是p27的降解过程的一个重要调控分子,可被磷酸化的Akt(p-Akt)激活进而参与p27的降解调节。本实验通过观察STS在整体和细胞水平抑制肺血管平滑肌细胞增殖的作用及其对p27影响,探讨STS治疗HPH的可能机制。并进一步采用基因重组技术,构建了HS-p27-pAcGFP1-1重组质粒,通过sm22启动子和低氧反应元件(hypoxia response element, HRE)增强子的共同作用使外源性p27靶向定位于处于低氧条件下的血管平滑肌细胞内,从而条件性调控p27的表达,实现特异性、靶向性、有效抑制低氧性PASMC增殖作用,达到防治HPH的目的,有望为HPH的防治提供新的策略和手段。一、STS上调p27的表达防治大鼠HPH的发生1、实验目的从整体和细胞两个水平观察STS抑制低氧诱导的肺小动脉重塑及PASMC增殖的作用及其对p27、Skp2及p-Akt的影响,探讨STS预防HPH发生和抑制低氧性PASMC增殖作用的可能机制。2、实验方法将大鼠或原代培养的大鼠PASMC分为四个组:常氧组(N),常氧给药组(N+STS),低氧组(H),低氧给药组(H+STS)。利用低压低氧舱复制大鼠的HPH模型;导管法检测血流动力学指标;计算右心肥厚指数;肺组织切片HE染色检测肺小动脉的形态学变化;MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化;RT-PCR检测肺组织和培养细胞中p27、Skp2的表达;Western-blot检测p27、Skp2和p-Akt的表达。3、实验结果(1)动物实验结果:低氧性肺动脉高压模型复制成功,STS可以明显减轻低氧引起的肺动脉高压和肺小动脉壁重塑。低氧使大鼠肺组织内p27的蛋白表达水平降低,但不影响p27mRNA的表达,低氧可激活Akt信号转导通路,使p-Akt表达明显增加,诱导Skp2在mRNA和蛋白表达水平升高;STS可以降低低氧引起的p-Akt表达的增多,抑制低氧诱导的Skp2mRNA和蛋白表达的升高,逆转低氧对p27蛋白表达的下调作用。(2)细胞实验结果:低氧刺激PASMC增殖,诱导细胞由G0/G1期向G2/S期的转化,激活Akt信号通路,p-Akt表达增加,诱导Skp2mRNA和蛋白表达增加,p27蛋白表达降低;STS可以抑制低氧引起的PASMC的增殖,减少低氧诱导的细胞周期转化,抑制低氧引起的Skp2和p-Akt升高及p27蛋白表达的减少。4、实验结论低氧通过Akt-Skp2-p27通路促进PASMC增殖,STS则可以阻断该通路抑制低氧引起的PASMC增殖。二、HRE增强的sm22启动子驱动p27靶向性抑制低氧引起的PASMC增殖的研究1、实验目的构建HS-p27-pAcGFP1-1重组质粒,条件性调控p27的表达,特异性、靶向性有效性的抑制低氧性PASMC增殖。2、实验方法应用PCR、酶切、连接等技术构建p27-pcDNA3.1、sm22-pAcGFP1-1、HRE-sm22-pAcGFP1-1、sm22-p27-pAcGFP1-1、HS-p27-pAcGFP1-1五种重组质粒。在不同种类的细胞转染sm22-pAcGFP1-1检测sm22启动子特异性;在PASMC转染HRE-sm22-pAcGFP1-1后给予常氧和低氧刺激检测HRE对低氧的反应性;MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期变化,Western-blot检测p27、Skp2的表达。3、实验结果(1)成功构建了五种重组质粒。(2)转染p27-pcDNA3.1后PASMC细胞增殖被显著抑制。(3)转染sm22-pAcGFP1-1质粒后48h,绿色荧光蛋白GFP在血管平滑肌细胞A10、PASMC中有表达,而在293、3T3、A549等非平滑肌细胞内未见表达。(4)转染HRE-sm22-pAcGFP1-1质粒后48h低氧组PASMC中的荧光强度明显强于常氧组。(5)PASMC在转染HS-p27-pAcGFP1-1后48h检测到p27的过表达且其在低氧组中的表达明显高于常氧组;转染组低氧诱导的细胞增殖被明显抑制,细胞周期阻滞于G0/G1期。4、实验结论重组质粒HS-p27-pAcGFP1-1可实现p27的可控性、靶向性表达,即受低氧(氧分压)调节、在血管平滑肌细胞中特异性表达,因此采用该质粒可特异性、靶向性抑制低氧性PASMC增殖。