丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科,主要经血液传播,是引起人类丙型肝炎的病原体。全球约有1.7亿人感染HCV,每年新增感染者达300万-400万。我国HCV感染者估计近4000万。HCV感染易慢性化,其慢性化率可高达85%,部分慢性丙型肝炎患者可发展为肝硬化,甚至肝细胞癌。目前主要采用聚乙二醇干扰素α联合利巴韦林治疗丙型肝炎,其效果明显受HCV基因型影响。2、3型HCV感染对该疗法的持续病毒学应答率(SVR)可达到75%,但1型HCV感染的SVR不到50%。目前全球范围内经血液以及血制品途径感染的丙型肝炎病例与上世纪九十年代以前相比有大幅下降,但在发展中国家血液和血制品仍然是传播HCV的重要途径。此外,每年散发性以及传播途径不明的丙型肝炎新发病例仍高居不下。控制HCV感染的关键措施还是依赖于开发出有效的疫苗,从1989年HCV基因组被克隆以来,丙型肝炎疫苗的研究在欧美和日本等发达国家一直是研究热点,但迄今未有有效的疫苗问世。HCV包膜蛋白E2位于HCV蛋白前体第384-746位氨基酸残基,由一个大的N端膜外区和一个C端疏水锚定区组成,与HCV另一包膜蛋白E1通过非共价键形成异源性二聚体。E2蛋白是介导病毒吸附和进入宿主细胞的关键蛋白,是诱导宿主产生HCV中和抗体的关键抗原,因此是疫苗研究的最主要靶标。然而,包膜蛋白高度变异,尤其E2蛋白氨基末端的含有27个氨基酸残基的高变区1(hypervariable region 1,HVR1)是HCV蛋白中变异频率最高的区域,也是公认的HCV中和抗体表位所在区域。HVR1是介导HCV与受体SR-BI结合的关键区域,HVR1与SR-BI的作用通过几种不同的机制促进HCV细胞侵入。HVR1抗体和SR-BI抗体均能阻断HCV感染。HVR1的高度变异曾被认为是遏制丙肝疫苗发展的瓶颈问题,近几年来基于HCV假病毒(HCVpp)以及细胞培养产生的HCV(HCVcc)的中和试验发现,HVR1并不是唯一的中和抗体表位所在区域,在HCV包膜E2蛋白中还存在一系列构象依赖的中和表位和线性中和表位,其中一些表位在不同基因型、亚型间高度保守。本实验室前期分别用分泌表达E2的表达质粒以及删除了HVR1的E2表达质粒免疫小鼠,然后检测、分析小鼠血清中的抗体以及病毒中和活性,结果显示:E2质粒免疫的小鼠血清中,HVR1抗体在总E2抗体中占很大比重,针对HVR1以外区域的抗体在中E2抗体中只占较小比重;删除HVR1可显著增强E2质粒免疫诱导的针对HVR1以外区域的抗体,小鼠免疫血清与其他基因型E2蛋白的交叉反应以及对其他基因型HCVpp的交叉中和活性也随之显著增强。这和急性HCV感染者血清中可检测到HVR1抗体而难以检测到E2抗体相似。结果提示:HVR1有可能抑制E2蛋白中保守表位的免疫原性,从而从另一个方面导致HCV免疫逃避。目前基于HCV包膜蛋白为主要靶抗原的疫苗均含有HVR1,这类疫苗免疫黑猩猩只能抵抗同株病毒攻击,但不能抵抗异株的攻击。HVR1的存在可能是这类疫苗免疫保护效果不理想的重要原因,删除HVR1也许能增强疫苗免疫对异株病毒攻击的保护效果。核酸疫苗在大动物的免疫效果远远不及在小动物的免疫效果,目前还没有核酸疫苗用于人类。为了进一步探讨用删除了HVR1的包膜E2蛋白作为HCV疫苗的发展前景,本研究用CHO细胞表达了E2以及删除了HVR1的E2蛋白,用亲和层析纯化出了两种E2蛋白,分析两种E2蛋白的构象、受体结合功能和抗原性,通过小动物免疫分析HVR1对E2蛋白免疫原性的影响,与我们用核酸免疫获得的结果进行对比和验证,探讨缺失HVR1的E2蛋白在丙肝疫苗中的应用前景。一、稳定表达HCV包膜E2-人IgG Fc融合蛋白的CHO细胞株的建立我们首先分别拼接HCV包膜蛋白E2-Fc和E2Δ-Fc融合基因(E2Δ指缺失HVR1),使E2与人IgG Fc段作为融合蛋白表达,方便目的蛋白的亲和层析纯化。将融合基因插入具有自主知识产权的CHO细胞表达质粒载体pCIDA-GS-neo(专利号:ZL 200610024202.5,发明名称:一种用哺乳动物细胞高效分泌表达丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法),然后分别将构建的表达质粒转染HEK 293T细胞,用ELISA及Western blotting方法检测培养上清中E2-Fc以及E2Δ-Fc融合蛋白,证实两者均可有效表达且表达水平相当。尔后,我们分别将这两种E2-Fc融合蛋白表达质粒及EGFP表达质粒(GS-EGFP)分别转染CHO细胞,以蛋氨酸亚氨基代砜(methionine sulphoximine,MSX)在不含谷氨酰胺的培养基内筛选表达目的蛋白的细胞克隆,用有限稀释法对粗筛出的细胞克隆进行进一步筛选,从而建立和获得了稳定分泌表达E2-Fc和E2Δ-Fc融合蛋白的细胞株。紧接着,我们对筛选出的贴壁CHO细胞株进行了无血清无蛋白培养的驯化,通过逐步下降培养基内血清的浓度,使细胞由贴壁状态转为悬浮生长,随后对悬浮细胞株的培养体系进行了放大,从75T方瓶培养经由250 ml三角烧瓶的小量放大,最后实现在Wave Bioreactor EH2/10细胞培养系统中2L细胞培养袋的灌流培养。细胞密度由最初的2×105cells/ml,达到最后的2×107cells/ml,细胞活率始终保持在80%以上,目的蛋白的分泌量也在灌流培养开始后稳定在3-4 mg/L左右。二、E2-Fc、E2Δ-Fc融合蛋白纯化及功能鉴定以上述的细胞培养上清为原料,离心去除细胞,继以GE公司超滤系统(QuixStand? Benchtop System)对上清液进行浓缩和超滤,将其浓缩约10倍,并去除其中分子量低于30 KD的蛋白质。随后,以ProteinA亲和层析柱HiTrap? Protein A HP Columns从超滤液中纯化融合蛋白,通过对柱压、洗脱条件、收集方式等参数的优化,从每升培养上清中可纯化出3-4 mg目的蛋白。然后用截留分子量为30 KD的离心型蛋白超滤柱以低温低速离心的方式将纯化出蛋白样品的缓冲液置换为pH为7.0的磷酸盐缓冲液。用构象依赖性单抗对最终纯化产物进行的Western blotting分析表明E2蛋白保持了天然空间构象。以糖苷酶EndoH、PNGase F分别对两种蛋白进行去糖基化处理,然后观察其分子量的变化,结果提示这两种蛋白的糖基化程度和形式相似。ELISA及Pull down实验显示E2-Fc,E2Δ-Fc均能与人CD81大胞外环(hCD81-LEL)结合,E2Δ-Fc结合活性较E2-Fc为高。检测两种蛋白与细胞膜表面表达的人CD81和SR-BI分子的结合活性,结果显示缺失HVR1后,E2蛋白与SR-BI的结合能力明显降低,与CD81的结合略有增强。流式细胞术检测发现两种蛋白均能与HCV易感的Huh7.5细胞结合且效率相当。将与E2蛋白结合后的Huh7.5细胞裂解,通过免疫共沉淀的方法检测介导E2蛋白与细胞结合的分子,结果显示,E2-Fc能将CD81及SR-BI共沉淀下来,而HVR1缺失的E2Δ-Fc共沉淀较多的CD81及少量SR-BI,提示HVR1是介导E2蛋白与靶细胞表面SR-BI结合的重要区域。两种蛋白均能抑制HCVpp和HCVcc的感染性,抑制率最高可达90%以上,且株特异性不强。三、删除HVR1增强E2-Fc融合蛋白的免疫原性分别将上述两种融合蛋白联合弗氏佐剂免疫小鼠,于0、3和8周每只小鼠皮下注射10μg佐剂乳化的融合蛋白,初免第2、7和10周采血检测小鼠血清中的E2ΔHVR1抗体及HVR1抗体,发现E2-Fc免疫组10只小鼠中,有5只E2ΔHVR1及HVR1抗体均为阳性,4只E2ΔHVR1抗体单阳性,1只两种抗体一直是阴性。E2ΔHVR1及HVR1抗体滴度随免疫次数增多逐步升高,E2Δ-Fc蛋白的确能诱导更高的E2ΔHVR1抗体水平,其滴度约为E2-Fc免疫组的5-10倍。证实HVR1的存在抑制了E2ΔHVR1抗体的产生。尔后,为进一步检测小鼠血清抗体中和活性,我们将各组小鼠血清混合后纯化出IgG,行病毒感染中和实验,结果显示,两组IgG对于与蛋白来源同株的H77株HCVpp感染中和效率没有显著性差异,中和率在80%以上。但对于异株HCV,E2-Fc组中和活性显著低于E2Δ-Fc组。含有HVR1的E2-Fc融合蛋白诱导的抗体中,HVR1抗体阳性则其交叉中和活性明显低于HVR1抗体阴性者,也说明HVR1抑制交叉中和抗体的产生。这些结果与我们DNA免疫的研究一致,高度提示缺失HVR1可有力促进HCV包膜E2蛋白诱导交叉中和抗体。此外,考虑到Fc段本身有特殊的免疫学功能,可能有助于免疫应答,尤其是细胞免疫应答的诱导。本研究中,采用融合蛋白免疫小鼠,该融合蛋白是否能在动物体内诱生针对E2蛋白特异且高效的细胞免疫反应,是我们需要进一步验证的内容。小结本研究着眼于丙型肝炎病毒蛋白疫苗的开发思路,在前期DNA免疫的基础上,构建了稳定表达E2-Fc/E2Δ-Fc的无蛋白无血清悬浮CHO细胞培养体系并成功纯化出相应的目的蛋白。功能试验结果显示,HVR1缺失并未明显影响E2蛋白的天然构象,HVR1删除后,E2蛋白与其受体CD81的结合增强,与SR-BI的结合能力减弱。动物免疫结果显示,HVR1的缺失显著增强了E2蛋白诱导的交叉中和抗体。综上所述,该研究首次从蛋白层面揭示了HVR1对E2蛋白结构、功能及免疫原性的影响,为HCV蛋白疫苗的开发提供了新思路。