论文部分内容阅读
本试验采用免疫学技术、微生物学技术、分子生物学技术、蛋白质技术等克隆表达了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)OmpV蛋白、从溶藻弧菌中提取了外膜蛋白Omp、从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)中提取LPS。初步研究了FKC、OmpV、Omp对大黄鱼的免疫保护作用、机体产生抗体的变化规律。免疫多糖对免疫有增强作用，可以提高黄鳝对嗜水气单胞菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的免疫反应。根据GeneBank上已登录的溶藻弧菌全基因序列中外膜蛋白OmpV基因序列设计1对引物。以分离到的溶藻弧菌总DNA为模板，用常规PCR方法克隆OmpV基因。PCR扩增出一条约720bp的特异条带。把克隆到的基因重组到pET30a载体后，在E．coli DH5α中大量克隆后，再把重组的质粒转到BL21中大量表达外膜蛋白OmpV。外膜蛋白OmpV经电泳后，发现其分子量为27kDa。免疫印迹试验表明我们提取的蛋白就是外膜蛋白OmpV。用提取纯化得到的外膜蛋白OmpV免疫大黄鱼，注射OmpV蛋白后大黄鱼没有出现不良症状，OmpV对鱼体没有毒性。攻毒试验表明OmpV蛋白对大黄鱼有80％的免疫保护力，是一种比较理想的疫苗。制备溶藻弧菌的FKC、OmpV、Omp这三种疫苗。分别用这三种疫苗免疫大黄鱼，从第28d开始到第56d每隔7d取血一次。从血液中分离血清，用ELISA法测定大黄鱼针对FKC、OmpV、Omp这三个抗原的抗体效价。通过第28d到第56d抗体效价的数据分析大黄鱼针对某个抗原产生的抗体的变化规律，研究最佳免疫接种时间。免疫FKC之后，大黄鱼的抗体水平在第28d或之前就达到了高峰。免疫OmpV后，大黄鱼的抗体水平在第35d左右达到最高。免疫Omp之后，大黄鱼的抗体水平在第49d的时候达到最高。研究数据表明，溶藻弧菌大规模爆发前30d是大黄鱼接种疫苗最佳的时期。将免疫多糖(酵母细胞壁)定量添加在饲料中投喂经过免疫接种A．hydrophila脂多糖的黄鳝后，通过测定供试鱼的特异性和非特异性免疫活性指标，评价了在饲料中添加免疫多糖(酵母细胞壁)对受免黄鳝免疫应答的增强作用。结果表明经过免疫接种LPS的黄鳝投喂免疫多糖(酵母细胞壁)后，供试黄鳝的白细胞吞噬活性增强、凝集抗体效价上升和经活菌攻毒后的死亡率下降，说明投喂免疫多糖(酵母细胞壁)能提高受免黄鳝的非特异性和特异性免疫应答水平。