第一部分：荧光定量PCR检测结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数实验方法的建立及优化目的：荧光定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)技术是检测结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数最常用的实验方法。本研究的目的是建立检测结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数较为稳定标准的RT-PCR实验方法,并加以优化,最后确定大样本实验检测的靶基因及样品来源。方法：分别合成BamEI-W和Pol-1基因引物及探针。以6例肿瘤组织中EBV阳性的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血浆提取的DNA为模板,运用PCR (Polymerase Chain Reaction)技术扩增BamEI-W和Pol 1基因片段,回收其产物,克隆到pGM-T载体,制备标准质粒。选择经测序验证正确的含BamRI-W基因的标准质粒,分别采用高浓度107、106、105、104、103及低浓度104、103、102、101、100五个梯度模板制作标准曲线。采用检测靶基因BamHI-W,运用RT-PCR初步检测6例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者及正常人对照血浆中游离EBV DNA拷贝数,同时设空白对照。分别运用BamHI-W与Pol-1基因进行样品初步检测并比较其实验效率。运用BamRI-W作为检测靶基因,采用RT-PCR技术分别检测30例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤血清及血浆中游离EBV DNA拷贝数并比较其差异。结果：基因测序表明扩增的BamHI-W与Pol 1基因序列正确。采用BamRI-W基因作为检测的靶基因扩增EBV DNA难度较小,阳性率高,优于Pol 1基因。分别采用高、低浓度制作标准曲线的线性相关性很好,曲线的斜率及扩增效率均在标准范围内。初步检测结果显示,6例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者血浆中均能检测到游离EBV DNA,而正常人及空白对照中均未检测到游离EBV DNA。以BamHI-W为检测靶基因,30例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者放疗前血浆及血清中游离EBVDNA中位拷贝数分别为1497与1639拷贝数/mL(p=0.200),相关系数(rp)为0.729(p=0.000)；放疗后分别为115与12拷贝数/mL(p=0.093),rp=0.497(p=0.005)。25例IE期结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者放疗前血浆及血清中游离EBV DNA中位拷贝数分别为1023与1088拷贝数/mL(p=0.244),rp=0.771(p=0.000)；放疗后均为0拷贝数/mL(p=0.109),rp=0.547(p=0.005)。30例结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者放疗前血浆中游离EBV DNA阳性率高于血清,分别为83.3%(25/30)与66.7%(20/30)(x2=2.222,p=0.136),放疗后分别为43.3%(13/30)与46.7%(14/30)(x2＝0.067,p=0.795)。结论：初步建立了检测结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数较为稳定标准的RT-PCR实验方法。BamEI-W基因为首选的检测靶基因。全组及早期结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤放疗前后血浆及血清中EBV DNA中位拷贝数无显著差异、呈明显正相关、阳性率相似。放疗前血浆中游离EBV DNA阳性率绝对值大于血清。可以考虑血浆作为检测样品来源的首选。本项研究为下一步大样本检测结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数,并探讨其与临床特征及预后相关性研究奠定了较好的基础。第二部分：结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数的临床意义目的：探讨结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数的阳性率、分布、放疗前后的变化规律,以及与临床分期和预后的关系。方法：30例经病理证实的结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者纳入此研究。根据Ann Arbor分期,ⅠE、ⅡE、ⅢE与IVE期患者分别为25例、4例、0例与1例。早期结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤首选放射治疗。30例患者中,单纯放疗15例、放疗+化疗8例及化疗+放疗±化疗7例。首程放疗23例,首程化疗7例。以BamHI-W作为检测靶基因,运用荧光定量PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)技术检测全组结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数。分析结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤外周血游离EBV DNA拷贝数的阳性率、分布、放疗前后的变化规律,以及与临床分期和预后的关系。结果：中位随访时间为21个月(范围：4-35个月)。全组结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者2年总生存率(Overall Survival, OS)和无进展生存率(Progression-Free Survival, PFS)分别为78.6%和55.1%。25例IE期患者的2年OS及PFS分别为83.8%和63.0%。全组患者放疗前血浆与血清中游离EBV DNA中位拷贝数分别为1497和1639拷贝数/mL。ⅡE-ⅣE期患者放疗前血浆及血清中游离EBV DNA中位拷贝数明显高于IE期患者(血浆2062比1023拷贝数/mL,p=0.043；血清2673比1088拷贝数/mL,p=0.068)。IE期患者原发肿瘤分期为T3/T4(15例)放疗前血浆及血清中游离EBV DNA中位拷贝数明显高于T1/T2(10例)(血浆2852比206拷贝数/mL,p=0.047；血清4654比131拷贝数/mL,p=0.066)。全组患者首程放疗的2年OS明显优于化疗,分别为87.5%和44.4%(p=0.009)。首程治疗后达完全缓解(complete remission, CR)患者2年PFS明显优于未达CR的患者,分别为59.0%和0%(p=0.002)。放疗前后游离EBV DNA拷贝数与预后明显相关。全组患者放疗前血浆中游离EBV DNA拷贝数≤500拷贝/mL的2年OS明显优于>500拷贝/mL的患者,分别为100%和66.3%(p=0.015)。放疗后为0拷贝/mL的2年OS优于>0拷贝/mL的患者(93.8%比58.9%,p=0.058)；放疗前血清中游离EBV DNA拷贝数≤500拷贝/mL的2年OS优于>500拷贝/mL的患者(100%比63.2%),差异具有边缘统计学意义(p=0.064),放疗后为0拷贝/mL的2年PFS明显优于>0拷贝/mL的患者(73.8%比35.0%,p=0.009)。IE期患者放疗前血浆中游离EBV DNA拷贝数≤500拷贝/mL的2年OS优于>500拷贝/mL的患者(100%比73.3%,p=0.089),放疗后为0拷贝/mL的2年OS明显优于>0拷贝/mL的患者(100%比62.3%,p=0.013)；放疗前血清中游离EBV DNA拷贝数≤500拷贝/mL的2年OS优于>500拷贝/mL的患者(100%比71.4%),具有边缘统计学差异(p=0.063),放疗后为0拷贝/mL的2年PFS明显优于>0拷贝/mL的患者(76.9%比50.0%,p=0.044)。结论：结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者放疗前血浆与血清中游离EBV DNA拷贝数与Ann Arbor分期及原发肿瘤T分期明显相关。全组及IE期结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者放疗前后血浆与血清中游离EBV DNA拷贝数均是重要的预后因素。第三部分：儿童及少年结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤临床特征和治疗结果目的：结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤主要发生于成人,儿童和少年极少见。本文目的是分析儿童及少年结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤的临床表现及治疗结果。方法：1988年1月至2008年6月在我院收治经病理证实、年龄≤21岁的37例儿童及少年结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤患者进入此研究。原发肿瘤位于鼻腔22例(59.5%),位于韦氏环15例(40.5%)。根据Ann Arbor分期,ⅠE、ⅡE、ⅢE和IVE期患者分别为19例(51.4%)、14例(37.8%)、2例(5.4%)和2例(5.4%)。治疗原则为单纯放疗或综合治疗,其中单纯放疗9例、放疗+化疗10例及化疗+放疗±化疗18例。33例早期患者以放疗为主,单纯放疗9例、放疗+化疗10例和化疗+放疗士化疗14例。评价首程放疗与化疗及首程治疗后的近期疗效。中位随诊时间42.1个月。采用Kaplan-Meier方法分析总生存率(Overall Survival, OS)及无进展生存率(Progression-Free Survival, PFS), Log-rank检验比较组间生存率,χ2检验分析比较组间比率。结果：全组病人男性多见,男女比例为1.85：1,中位年龄为17岁(范围为7-21岁)。23例(62.2%)伴有B症状。LDH升高16例(51.6%)。一般状态评分(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)0、1与2分病人分别为9例(24.3%)、23例(62.2%)和5例(13.5%)。国际预后指数(International Prognostic Index, IPI)评分0、1与2分病人分别为16例(43.2%)、17例(45.9%)和4例(10.8%)。采用年龄修正的IPI(age-adjusted International Prognostic Index, aaIPI)评分为0、1、2与3分病人分别为10例(27.0%)、15例(40.5%)、9例(24.3%)和3例(8.1%)。伴有颈部淋巴结转移17例(45.9%),其中颌下淋巴结与颈上深组淋巴结转移分别为9例(24.3%)与12例(32.4%)。放疗与化疗的完全缓解(Complete Remission, CR)、部分缓解(Partial Remission, PR)、稳定(Stable Disease, SD)与进展(Progressive Disease, PD)率具有明显的统计学差异(p=0.001)。首程放疗CR率明显高于化疗(73.7%比16.7%,p=0.002)。首程治疗后各组近期疗效无显著差别(p=0.112)。全组病人5年OS及PFS分别为77.0%和68.5%。早期(IE和IIE期)病人的5年OS和PFS分别为77.6%和72.3%。单因素分析显示首程治疗的CR率是唯一与OS及PFS相关的预后因素。首程治疗后获得CR的患者5年OS及PFS明显优于未达CR患者,分别为84.8%和30.0%(p=0.006)及77.3%和0%(p=0.000)。而性别、一般状态评分(0/1、2/3)、颈部淋巴结是否受侵、B症状、LDH、aaIPI、Ann Arbor分期以及首程治疗模式均与预后无关。结论：儿童及少年结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤主要表现为病灶局部侵犯,ⅠE、ⅡE期多见。肿瘤对放疗敏感,对化疗相对抗拒。采用放疗为主的治疗模式预后较好。近期疗效是重要的预后因素。