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氧化还原平衡对于维持细胞功能具有重要的作用,尤其是内质网内的氧化还原失衡如氧化应激的发生会导致细胞功能的紊乱,进而诱发多种疾病。尤其是大脑作为耗氧量最高的器官极易发生氧化应激,抑郁症等神经疾病的发生都与氧化应激密不可分。内质网内氧化还原稳态的维持离不开硫醇类小分子、还原性金属离子等生物活性小分子的调控。因此在活体中检测大脑中的还原性物质(如内质网内的小分子硫醇和Cu~+),对于深入理解氧化应激与脑部疾病的发生发展具有重要的意义。双光子荧光技术(TPM)相比于单光子荧光具有更深的穿透深度、较低的背景荧光等优点,更适合用于活体脑部组织的成像。考虑到大脑的复杂结构和小分子透过血脑屏障的能力,小分子荧光探针是用于活体大脑成像的有力工具。然而目前利用双光子荧光成像对抑郁症小鼠大脑内内质网中的还原性小分子硫醇和Cu~+变化的研究至今还未报道。因此,本文开发了两种小分子荧光探针,分别用于活体脑部小分子硫醇以及Cu~+的双光子成像,为抑郁症发病机制和抗抑郁治疗的研究提供了新策略和新工具。本文中我们开展了以下两方面的工作:1.设计了一个内质网靶向的特异性响应硫醇小分子的双光子荧光探针ER-SH,实现了对细胞、活体组织以及小鼠大脑内的硫醇分子的检测。ER-SH由1,8-萘二甲酰亚胺、2,4-二硝基苯磺酰胺和甲基苯磺酰胺组成。由于光诱导的电子转移(PET)机制,1,8-萘二甲酰亚胺荧光团的荧光被有效地猝灭。当有硫醇存在时,2,4-二硝基苯磺酰胺被硫醇水解,PET过程被打断,1,8-萘二甲酰亚胺荧光团的荧光恢复。实验结果表明,ER-SH对硫醇分子具有较高的灵敏度和选择性。此外,ER-SH具有优异的靶向内质网的能力,利用双光子成像技术,ER-SH成功地揭示了在内质网应激状态下硫醇水平的提高。更重要的是,双光子活体成像结果首次揭示了抑郁症小鼠大脑内的硫醇减少。总的来说,这项工作有助于进一步了解抑郁症的分子机制,为诊断和抗抑郁治疗提供了一个关键的工具。2.设计了一个内质网靶向的检测活细胞及活体中亚铜离子(Cu~+)的浓度变化的荧光探针ER-Cu,该探针能够实现对细胞以及小鼠大脑内Cu~+的检测。探针ER-Cu由三部分组成:以1,8-萘二甲酰亚胺作为荧光发色团,以甲基苯磺酰胺作为内质网靶向定位基团,以能够与Cu~+络合配位的3,6,12,15-四硫-单偶氮十七烷基团作为Cu~+识别基团。由于PET效应,1,8-萘二甲酰亚胺荧光团的荧光被有效地猝灭。当有Cu~+存在时,Cu~+与硫原子络合后,PET过程被打断,1,8-萘二甲酰亚胺荧光团的荧光恢复。实验结果表明,ER-Cu对Cu~+具有较高的灵敏度和选择性,此外,ER-Cu具有优异的靶向内质网的能力。该探针有望实现Cu~+在抑郁症小鼠大脑中的荧光成像,并且为抑郁症的分子机制研究提供思路。