酵母表面展示和噬菌体展示技术已成为蛋白质工程,尤其是抗体工程中广泛应用的强大工具。其中酵母展示技术可以结合流式细胞术,直接分析展示蛋白的表达、稳定性以及与互作蛋白的亲和力,从而成为高效的文库筛选体系。酵母表面展示技术已被广泛用于针对各种抗原的单链抗体(scFv)筛选及其优化。然而,基于酵母表面展示技术的scFv文库筛选流程中仍存在一些缺陷,限制了系统筛选效率。本研究主要针对scFv文库构建与筛选中存在的两个限制因素,对酵母表面展示体系进行优化。首先,scFv文库多样性片段是通过PCR扩增、PCR法随机突变获得,再整合到酵母表面展示载体上,构成scFv文库。然而,这一过程中往往会不可避免地在部分scFv片段内部引入终止密码子,导致不能表达完整的单链抗体。文库中这样的片段占比增加,不仅影响有效库容量,还影响筛选效率。其次,筛选的scFv亚文库一般需要进行高温稳定性验证,获得稳定性更高的目标scFv。而传统验证体系中存在的问题是,当筛选出的scFv库需要进行高温稳定性筛选或验证时,往往由于酵母本身不耐高温而需要将热激后的细胞收集起来提取文库质粒,再重新转入工程酵母中流式分选。这个过程不仅耗时耗力而且会造成文库质粒丢失,降低其多样性。本研究通过引入核糖体跳跃肽(T2A)对基于Aga1-Aga2的酵母表面展示系统进行改造,即在Aga2的碳末端插入T2A-Leu2序列,使得scFv、T2A序列与营养筛选基因LEU2能转录成同一条mRNA。翻译时核糖体识别T2A序列,跳跃翻译成scFv和Leu2两个独立蛋白。若前端的scFv序列中含有内部终止密码子,核糖体就无法继续向后翻译,则不能表达Leu2蛋白,因此含此质粒的酵母不能在亮氨酸缺乏的培养基中生长。基于这一策略,本课题通过试验证明,T2A-Leu2体系可以有效排除含内部终止密码子的scFv序列。此外,本课题将针对CD38的scFv亚文库片段分别构建在T2A-Leu2体系及改造前体系中,通过流式分选验证,证明改造后的展示系统能更高效地筛选到阳性抗体。同时,本研究通过甲基磺酸甲酯(MMS)随机诱变法,获得了既耐温又不影响展示功能的工程菌。接着通过高温热激,免疫印迹及流式分选的方式证明了筛选获得的耐温菌株可以正常表达及展示scFv,不影响其筛选scFv文库的功能。在操作中使用耐温展示酵母进行筛选和热激检测,热激后的酵母可直接扩增培养,进行流式分选。这一改造简化操作步骤,极大地优化了scFv筛选体系。本课题另一方面,利用表面展示系统提高了酵母钝化重金属的能力。这一策略是将金属硫蛋白展示在酵母细胞表面,直接与环境中重金属离子结合,从而使重金属离子由游离态变为结合态,降低其毒性。通过免疫印迹及流式分选技术证明金属硫蛋白正常表达并展示在细胞表面。通过原子吸收光谱法检测表明展示金属硫蛋白的酵母能有效提升其结合重金属的能力。为治理环境重金属污染提供了一个有效策略。