基于纳米光学传感的病原菌智能检测方法研究

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病原菌引起的感染性疾病一直是全球危害最大的公共卫生问题之一,现有的病原菌感染诊断技术无法在时效性、操作便捷性、设备成本、灵敏度等方面形成统一,难以满足实验室检测和现场即时检测的现实需求。论文研究针对上述问题,对纳米光学传感技术与人工智能分析技术开展深入研究:一方面以新型银纳米颗粒(正电纳米银及适配体介导纳米银)作为传感表面增强拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)的基底,通过静电引力或核酸适配体与病原菌进行广谱/特异性的结合,从而获得病原菌的高质量SERS指纹信号,然后基于一维卷积神经网络(Convolutional Neural Networks,CNN)构建新型光谱分类模型并准确鉴定临床样本中的病原菌,建立适用于实验室精准检测的光学分析新技术;另一方面以高性能复合量子点微球作为荧光探针,利用万古霉素及抗体的双重识别模式构建了高灵敏的侧流层析(Lateral Flow Assay,LFA)检测技术,同时研发了具备图像增强功能的荧光读取仪进一步提升免疫层析的灵敏度,建立了适用于病原菌现场快速检测的新型工程系统。两种技术互为补充为病原菌检测提供了一套系统性的解决方案,论文的主要工作如下:1、建立了一种基于新型纳米银SERS传感和CNN分析的病原菌实验室精准检测技术。(1)研究新型银纳米颗粒与细菌的结合方式实现高质量SERS传感:首先,开展了基于正电纳米银(AgNPs+)的病原菌SERS传感技术研究,验证了 AgNPs+用于副溶血弧菌、单增李斯特菌等四种食源性致病菌的广谱SERS效应并进行方法学评价;其次,开展了基于适配体介导银纳米颗粒原位合成(Aptamer-AgNPs)的病原菌SERS传感技术研究,验证了 Aptamer-AgNPs用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的特异性SERS效应并进行方法学评价。(2)设计了包含全局梯度融合结构与特征加权结构的新型分类网络GFNet用于SERS指纹谱的分析。(3)构建了两项SERS-CNN病原菌实验室检测技术并联合医院检验部门开展实验研究:技术一,联合基于AgNPs+的SERS传感技术与GFNet模型开展了八种病原菌广谱识别以及四种志贺菌血清型分型,识别与分型准确率均达到达到100%,检测限为102 cells/mL;技术二,联合基于Aptamer-AgNPs的SERS传感技术与GFNet开展金黄色葡萄球菌敏感株与耐药株的快速鉴定,准确率达到100%,检测限为102 cells/mL。2、建立了一种基于硅核量子点免疫层析和图像增强的病原菌现场即时检测系统。(1)研制了高性能硅核量子点微球作为比色/荧光双信号探针,基于万古霉素及抗体组合提出了一种具备双重识别模式的荧光免疫层析系统,优化了修饰抗体浓度、纳米标签数量以及释放缓冲液配方等指标。(2)提出了PBD-Retinex算法实现微弱荧光的稳定增强,并完成了便携式荧光成像增强读取仪的设计与工程化研制。(3)建立了“基于硅核量子点荧光免疫层析与图像增强的病原菌现场即时检测系统”并联合医院检验部门以及食品安全检验部门开展了两项实验研究:针对食品安全快检,实现了蔬菜汁、牛奶等食品样本中金黄色葡萄球菌的特异性快速检测,比色信号和荧光信号的检测限分别为104和102 cells/mL、荧光定量误差小于7.60%、耗时约为12 min;针对血流感染快检,实现了人类全血样本中金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的快速检测,荧光信号的检测限为500cells/mL、荧光定量误差小于5.40%、耗时约为12 min。总之,论文研究和提出了“基于新型纳米银SERS传感和CNN的病原菌实验室精准分析技术”与“基于硅核量子点荧光免疫层析和图像增强的病原菌现场即时检测系统”。两种病原菌检测技术在应用场景上互为补充,相关指标在联合一线检验部门开展的多项实验研究中得到可靠的验证,表明研究成果具备较好的应用前景,有潜力为不同场合多种病原菌的精准、快速检测提供系统性的解决方案。
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