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鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD)是由马立克氏病毒(Marek’disease virus,MDV)引起的免疫抑制和淋巴细胞肿瘤性禽病。近年来,尽管MD可用商品化的疫苗来保护,但MD的不断爆发已导致MDV的毒力增强,其致病性也逐渐增大,MD仍然是一个严重的威胁,给世界养殖业带来巨大的经济损失。因此,需要增强现有疫苗的控制措施以及寻找新的替代策略。宿主MicroRNA(miRNA)在转录后调控水平发挥多种生物学功能,它们可能在诱导MD肿瘤形成过程中发挥重要的调控作用。我们前期以自主培育的B21(抗性)和B19(易感)单倍型SPF鸡为模型,利用高通量测序技术构建了B21和B19鸡在MDV病毒感染三个关键阶段(5、14和25dpi)脾脏组织miRNA的差异表达谱,发现gga-miR-7b显著差异表达。因此,我们以gga-miR-7b作为研究目标进行深入研究。(一)利用Targetscan和miRDB两个生物学软件分别预测gga-miR-7b的靶基因,取二者交集并结合GO分析筛选与肿瘤、免疫等相关的靶基因,共筛选出5个候选靶基因(VDAC1、KLF4、SATB1、SNCA、TCF12)。(二)采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析上述候选靶基因在B21、B19单倍型SPF鸡MDV感染三个关键阶段(5、14和25dpi)脾脏组织的表达变化规律。通过qRTPCR结果分析,我们选取VDAC1、KLF4、SNCA进行候选靶基因验证。(三)利用双荧光素酶报告基因系统进行gga-miR-7b的候选靶基因体外验证,结果显示:gga-miR-7b可以结合到VDAC1、SNCA的mRNA 3’UTR区,抑制萤火虫荧光素酶活性(p<0.05)。qRT-PCR和Western blot检测发现,gga-miR-7b抑制VDAC1基因的mRNA和蛋白表达(p<0.05)。上述结果证实了VDAC1是gga-miR-7b调控的靶基因。(四)运用CCK-8和Transwell小室实验分析gga-miR-7b和VDAC1对MDCC-MSB1细胞的增殖和迁移的影响。结果显示:gga-miR-7b可抑制MDCC-MSB1细胞的增殖和迁移(p<0.05);利用siRNA敲低VDAC1后,MDCC-MSB1细胞的增殖则受到了抑制(p<0.05),同时降低了MDCC-MSB1细胞的迁移,尽管没有达到显著水平。更有趣的是,敲低VDAC1后,MDV致瘤基因Meq的mRNA表达也受到了显著抑制(p<0.05)。综上所述,本研究证实了VDAC1是gga-miR-7b调控的功能靶基因,并且gga-miR-7b可能通过调控VDAC1抑制MDCC-MSB1细胞的增殖和迁移。gga-miR-7b及其调控的靶基因VDAC1很可能与MD肿瘤形成及MDV感染有关。