心肌细胞纤维化会导致包括心力衰竭、心房颤动、心肌缺血、甚至心源性休克等心脏疾病,严重危害全人类的健康。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin angiotension aldostenone system,RAAS)与转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是心肌纤维化的主要发病机制,尤其TGF-β1是目前已知的与组织纤维化的发生关系最密切的生长因子,具有调节细胞生长和分化、促进细胞增殖、抑制炎症等生物学功能。Tripartite motify-containing 72(Trim72)基因共有7个外显子(又称为MG53,Gene ID:365377),编码477个氨基酸,蛋白分子量为53 Kd。Trim72在慢性心衰中的作用及分子机制研究仍不清楚,故本文以SD大鼠为模型,主要研究Trim72在心衰组织中的表达,对心肌成纤维细胞增殖和迁移能力的影响及其分子机制。第一部分:基于生物信息学分析心衰中的差异表达基因目的:运用GEO公共数据库中表达谱数据,结合生物信息学的方法分析在慢性心衰中的差异基因,参与的生物学过程和信号通路,寻找和心衰密切相关的基因。方法:本部分研究以GEO公共数据中的心衰表达谱数据为分析材料,运用EC和TAC软件分析心衰中差异表达的基因,进一步结合生物信息学的方法分析差异基因参与的生物学过程和信号通路,mrna-mrna共表达网络使用cytoscape进行网络构建。利用cluego插件对基因集做kegg信号通路,geneontology,reactom通路等富集分析。结果:在获取表达矩阵后,使用r中limma包分析两两之间的差异表达基因,共有950个差异基因,430个上调基因,520个下调基因。采用go富集分析950个差异表达基因的生物学过程,发现它们显著富集于细胞增殖(cellproliferation)、细胞外基质重塑(ecm)、细胞骨架发育、刺激应答(responsetostree)、信号调控(regulationofsignaling)、代谢调节(regulationofmetabolicprocess)等生物学过程。结合kegg数据库,对差异表达的基因进行pathway信号通路富集分析,pathway生物信息学分析结果显示,差异基因主要富集在tgfsignalingpathway、hipposignalingpathway、pi3k-aktsignalingpathway、wntsignalingpathway、cytokinereceptorinterationsignalingpathway等。结论:trim72可能在心力衰竭的发生中发挥重要作用。第二部分trim72在sd大鼠心衰模型中的表达目的:构建sd大鼠慢性心衰模型,研究trim72在sd大鼠慢性心力衰竭模型心脏组织中的表达情况,初步探讨trim72在慢性心力衰竭心肌纤维化发生和进程中的作用,为trim72在慢性心衰中的诊断和治疗提供理论依据。方法:我们基于生物信息学分析的结果,预测到trim72在心脏衰竭的发生发展中起到重要的作用,故本部分采用腹主动脉狭窄法诱导sd大鼠发生慢性心衰,采用超声心动、he和masson染色法鉴定心衰模型,运用real-timepcr、westernblot和免疫组织化学等技术检测,心衰标本和正常标本组织中trim72mrna和蛋白水平的表达情况。结果:采用腹主动脉狭窄法在sd大鼠中成功复制了慢性心力衰竭,超声心动图和masson染色结果显示,sd大鼠慢性心力衰竭模型构建成功。免疫组织化学结果显示,trim72在正常sd大鼠的心脏中低表达或不表达,在慢性心衰sd大鼠心脏中高表达。结论:trim72在慢性心衰sd大鼠心脏中高表达,有可能成为一个慢性心衰的辅助诊断标志物。第三部分沉默mg53对sd大鼠心肌成纤维细胞生物学行为的影响目的:研究沉默trim72的表达对心肌成纤维细胞增殖和迁移能力的影响,明确trim72在心肌成纤维细胞中的作用。方法:采用胰酶和胶原酶联合消化sd乳鼠的心脏组织,差速贴壁离心法分离心肌成纤维细胞,形态学观察和免疫荧光法鉴定心肌成纤维细胞。用原代分离培养的cfs细胞为模型,用小干扰rna技术沉默cfs细胞中trim72的表达,实验分为3组:空白组,阴性对照组,sirna实验组。sirna转染48h和72h后,realtimepcr及westernblot分别检测trim72在mrna和蛋白水平上的干扰效果。cck-8实验检测沉默trim72后cfs细胞的增殖变化,transwell检测沉默trim72后cfs细胞的迁移变化。结果:采用胰酶和胶原酶联合消化sd乳鼠的心脏组织,差速贴壁离心法分离心肌成纤维细胞,在含10%胎牛血清dmem低糖培养基中常规细胞条件培养24h,倒置显微镜下可观察到细胞形态呈多样,细胞胞体较大、平坦,形态多为纺锤形,无自发搏动。胞质透明,颜色淡,显得很薄,细胞核较大呈卵圆形,居中,细胞状态良好,生长迅速。在荧光显微镜下可见细胞呈多角形或梭形,乳鼠心肌成纤维细胞sma抗原表达呈阳性,细胞纯度大于97%。由此可以鉴定为心肌成纤维细胞。sirna转染48和72h后,realtimepcr及westernblot结果显示,与空白组和阴性对照组相比,实验组sirna能有效沉默trim72在mrna和蛋白水平上的表达。cck-8和transwell结果显示,与空白组和阴性对照组相比,实验组cfs细胞的增殖和迁移能力明显下降。结论:沉默trim72的表达能抑制cfs细胞的增殖和迁移能力。第四部分初步探讨trim72在心肌成纤维细胞中的分子机制研究目的:初步探讨trim72在心肌成纤维细胞的增殖和迁移能力中的分子机制,寻找trim72调控的信号通路和下游靶基因。方法:本部分研究运用基因表达谱芯片寻找trim72参与的信号通路及下游靶基因;首先,我们运用前期筛选的trim72-sirna转染cfs细胞,沉默trim72的表达,trizol提取转染48h后的总rna,利用大鼠基因表达谱芯片分析抑制trim72表达后基因的表达变化。然后,运用ec和tac等软件结合生物信息学,对差异表达的基因进行geneontology和pathway信号通路分析,寻找trim72参与的生物学过程。结果:基因表达谱结果显示,trim72-sirna抑制心肌成纤维细胞中trim72的表达后,共有265个基因发生显著性变化,其中123个基因表达上调,142个基因表达下调。go生物信息学分析结果表明:上述差异表达的基因显著富集于celladhesion、skeletalsystemdevelopment、Heart development和Extracellular matrix organization等生物学过程;Pathway生物信息学分析结果显示:差异表达的基因主要富集于TGF-beta signaling pathway、Cell adhesion molecules(CAMs)、Hippo signaling pathway和Calcium signaling pathway等信号通路。结论:整合差异表达的结果和GO、Pathway结果,我们推测Trim72可能通过TGF-beta signaling pathway通路发挥作用,qRT-PCR和Western blot结果也得到了进一步的验证。这些结果表明,Trim72可能通过上述通路和/或基因的表达变化参心肌成纤维细胞的增殖和迁移能力。