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神经生长因子(NGF)作为神经营养素家族的一员,被证明在多种组织和器官中表达,包括雄性的生殖系统,并在雄性生殖生理中起重要作用。但到目前为止具体的分子机制仍不清楚。本课题以新生牛睾丸支持细胞(NBS)为对象,研究了NGF调节NBS细胞增殖的分子机制。研究的主要内容与结果如下:1、细胞鉴定和NGF在NBS细胞上的表达本试验利用免疫荧光技术成功鉴定出NBS细胞内FSHR的表达,利用吉姆萨染色观察NBS细胞发现符合睾丸支持细胞的形态学特点:细胞呈现梭形,细胞核大而明显,细胞核内部核仁周围存在两到三个卫星小体;神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和干细胞因子(SCF)作为睾丸内支持细胞特有的分子标记被成功检测到转录本。证明了所用的NBS细胞是牛睾丸支持细胞。利用免疫荧光技术鉴定出NGF及其受体TrkA在NBS细胞中大量表达。2、NGF对NBS细胞增殖的作用CCK8细胞增殖实验检测发现在体外用NGF(100 ng/ml)处理NBS细胞18小时,对细胞具有提高活力的作用。检测细胞增殖相关基因,Inhibin-B和紧密连接相关基因的表达水平,发现NGF可以有效促进NBS细胞增殖基因CCNE2、CCND1、PCNA的表达,并促进细胞Inhibin-B和胞质特化连接相关基因Vinculin的表达。采用siRNA干扰技术降低NBS细胞内源NGF的表达。发现NBS细胞活力出现下降。检测上述基因的表达发现,NGF的敲低可有效抑制细胞增殖基因CCNE2、CCND1、PCNA的表达,并抑制细胞Inhibin-B和Vinculin的表达,从而抑制细胞增殖。3、NGF调节NBS细胞增殖的机制添加NGF高亲和力受体TrkA的抑制剂K252α,发现NGF通过受体TrkA促进NBS细胞增殖。另外检测发现NGF可在短时间内明显激活NBS细胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路。添加PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002或MAPK/ERK信号通路的抑制剂PD98059。发现NBS细胞添加抑制剂处理后,NGF对细胞增殖的促进作用明显降低。采用qRT-PCR和Western blot技术检测发现PI3K/AKT信号通路参与NGF对NBS细胞增殖基因CCNE2,CCND1,Inhibin-B以及Vinculin表达的促进作用;MAPK-ERK信号通路参与NGF对NBS细胞增殖基因CCNE2,PCNA,CCND1以及Inhibin-B表达的促进作用。上述实验结果表明,NGF通过其高亲和力受体TrkA激活NBS细胞中PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路,促进细胞增殖基因CCNE2、CCND1、PCNA,以及细胞Inhibin-B和Vinculin的表达,调节NBS细胞的增殖。上述所有试验研究结果将有助于进一步了解NGF在雄性生殖中的作用,并为睾丸发育不全和精子发生障碍等生殖方面的问题提供新的治疗靶标。