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脂滴是普遍存在于各种生物体中的一种细胞器,在细胞内脂质代谢过程中起着核心作用。脂滴内部由中性脂组成,主要是甘油三酯和固醇酯类,表面由单层磷脂膜组成并被各种脂滴蛋白包被。由于脂滴与人类许多代谢性疾病密切相关,因此脂滴生物学的研究受到了越来越多的关注。同时,由于化石能源的不断消耗,新能源的开发成为亟待解决的问题。以微生物柴油为代表的液质生物能源也成为一个理想的研究方向。
鉴于真核生物细胞中存在多种细胞器之间的各种相互作用以及复杂的基因表达调控,用原核生物来进行脂滴形成及动态变化的研究更具有优越性。原核细菌浊红球菌Rhodococcus opacus PD630属于革兰氏阳性菌,并且在菌体中仅含有脂滴这一种细胞器,便于进行观察和检测。更重要的是,这种菌株中的甘油三酯含量可以达到细胞干重的87%,并可利用有机废水等作为营养物质进行生长繁殖,可以作为发展生物能源的优良菌种。
本文使用浊红球菌R.opacus PD630为模式系统,对脂滴的形成及动态变化进行了初步研究。首先,我们对该菌种进行全基因组测序,发现其全基因组大小为9.1 Mbp,包括一个环形的染色体和9个自身质粒。其次,我们纯化了R.opacusPD630中的脂滴并通过形态学和生物化学的方法鉴定了脂滴的纯度。然后通过一次切带和两次shotgun的质谱方法分别得到了430、299、305个脂滴蛋白。大部分脂滴蛋白属于代谢性的酶类,其它的包括膜转运相关蛋白、转录翻译相关蛋白、细胞分裂相关蛋白以及分子伴侣蛋白等。并且其中10个主要的脂滴蛋白通过Western blot验证8个主要存在于脂滴组分中。
基于蛋白质组学的分析,我们选定一些蛋白对其进行初步的功能研究,包括四个丰度较高的脂滴主要蛋白,一个与细胞分裂有关的蛋白,以及Dynamin-like蛋白和SNARE-like蛋白。研究发现:其一,脂滴主要蛋白之一的Apolipoprotein家族蛋白LPD06283,经基因敲除后突变株中的脂滴相对于野生型脂滴明显变大。当四个脂滴主要蛋白基因ro02104-ro06757-ro06190-ro06200同时缺失后,细胞内脂滴变大且脂滴数目减少。于此同时经质谱鉴定突变株脂滴上的主要蛋白为一种脱氢酶Ro01408,并且经基因过表达验证后该蛋白定位于脂滴上。其二,ParB类蛋白在已报道的研究中主要负责染色体的正常分离,在Rhodococcus系列菌株的研究过程中,发现ParB类蛋白通过调节细菌的生长分裂而影响了菌体内脂滴的代谢周期。其三,对于脂滴形成过程相关基因的研究中,主要以Dynamin-like蛋白作为研究对象,初步发现在菌体培养的某一阶段,菌体内的中性脂会倾向于集中在质膜上。其四,在对脂滴动态变化相关基因的研究中,主要对SNARE-like蛋白进行分析,发现这类蛋白主要定位于菌体质膜上。但这些蛋白究竟怎样参与到脂滴的形成和动态变化的过程中还需要进一步的研究和探讨。