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目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)作为一种侵袭性恶性肿瘤,临床进展迅速,肝癌细胞极易播散和转移。然而,目前对HCC分子机制的了解仍不够深入,肝癌的化疗耐药也面临着严峻挑战等诸多因素都限制了治疗效果的提高。因此,更进一步研究肝癌发生发展的机制,寻找新的生物标志物和治疗靶点具有重要意义。SAMHD1(SAM domain and HD domain-containing protein 1)属于一种宿主限制性天然免疫分子,已被证实在HIV、HBV和HSV等多种病毒中发挥抗病毒作用。近年来研究发现SAMHD1在肺癌、乳腺癌多种肿瘤细胞增殖过程中发挥重要作用,但尚未见SAMHD1与肝癌中具体的生物学功能及相关机制的研究报道。为了研究SAMHD1对肝癌中的生物学功能,阐明其调控机制,我们探索了 SAMHD1在肝癌细胞中的表达情况,通过基因功能策略(基因沉默和过表达)研究SAMHD1对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,最后初步阐明SAMHD1通过调控细胞周期抑制蛋白p27的表达,抑制肝癌细胞增殖的机制。方法:第一部分:SAMHD1对肝癌细胞生物学功能的影响。1.首先利用Western blot检测SAMHD1在正常永生化肝细胞系(L02)以及四种肝癌细胞系(PLC/PRF/5、Hep3B、Huh7、HepG2)中的表达情况。2.利用CRISPR/Cas9技术,在肝癌细胞Huh7和HepG2上构建敲除SAMHD1的稳定细胞系,在Huh7细胞上构建过表达SAMHD1及突变体(SAMHD1-D207N和SAMHD1-T592E)的稳定细胞系。3.在构建的稳定细胞系上通过MTT实验、克隆形成实验检测SAMHD1对肝癌细胞增殖的影响;利用流式细胞术检测SAMHD1对肝癌细胞的周期分布变化以及凋亡的影响。第二部分:SAMHD1抑制肝癌细胞增殖的分子机制研究。1:RT-qPCR 和 Western blot 检测细胞周期蛋白(cyclinA、cyclinB、cyclinD和cyclinE)、周期蛋白依赖性激酶(CDK1、CDK2、CDK4和CDK6)、细胞周期蛋白抑制剂/激酶抑制剂(p21和p27)、Rb以及磷酸化的CDK2和Rb的变化。2.在TCGA数据库中用Pearson相关性分析临床373例HCC组织样本中p27的表达与SAMHD1的相关性。3.在敲除SAMHD1的HepG2细胞中分离细胞浆与细胞核蛋白,Western blot检测p27在胞浆胞核中分布的变化。4.Western blot分析敲除SAMHD1后Akt以及活化状态p-Akt的蛋白表达水平变化。5.在稳定敲除SAMHD1的肝癌细胞系上,分别用不同浓度的Akt抑制剂LY294002处理细胞,MTT实验检测细胞的增殖,Western blot检测p-Akt的蛋白表达水平变化。结果:第一部分:SAMHD1对肝癌细胞生物学功能的影响。1.SAMHD1 在四种肝癌细胞系(PLC/PRF/5、Hep3B、Huh7、HepG2)中的蛋白表达水平较正常L02细胞系分别上调3.7、2.3、1.7和4.3倍。2.敲除SAMHD1基因后,显著促进肝癌细胞系HepG2或Huh7的增殖和克隆形成能力,细胞周期G2/M所占比例增加,G1/G0占比减少,细胞的早期凋亡和晚期凋亡均无无明显变化;相反,过表达野生型SAMHD1、SAMHD1 dNTP酶活性中心突变体(SAMHD1-D207N)和SAMHD1T592磷酸化位点突变体(SAMHD1-T592E)可以显著抑制肝癌细胞Huh7的增殖,细胞周期G1/Go期所占比例增加,G2/M占比减少,细胞凋亡没有变化。第二部分:SAMHD1抑制肝癌细胞增殖的分子机制研究。1.Western blot结果显示敲除SAMHD1后p27 mRNA和蛋白水平的表达减少,CDK1、cyclinD、p-CDK2和p-Rb表达水平增加;过表达SAMHD1以及突变体(SAMHD1-D207N和SAMHD1-T592E)后p27 mRNA和蛋白水平的表达增加。2.Pearson相关性分析373例临床HCC组织样本显示,p27的表达与SAMHD1呈正相关(r=0.2812,P<0.0001)。3.敲除 SAMHD1 后,Western blot 结果显示 Akt蛋白水平表达不变,其活性状态的磷酸化形式p-Akt蛋白水平增加。4.分离胞浆胞核蛋白后,Westernblot结果显示部分p27从细胞核转移至细胞质。5.用0μM、10μM、20μM的PI3K抑制剂LY294002处理稳定敲除SAMHD1的HepG2细胞后,MTT实验结果显示LY294002可以随着浓度增加,细胞增殖越慢,并且可以逆转SAMHD1对肝癌细胞增殖的影响。p-Akt蛋白水平随着LY294002浓度增加而下降。结论:SAMHD1蛋白在肝癌细胞系中高表达;SAMHD1可以抑制肝癌细胞(Huh7和HepG2)的增殖,这种抑制作用不依赖于其突变体(SAMHD1-D207N和T592E)形式,且SAMHD1不影响细胞的凋亡;作用分子机制为:SAMHD1可以作用于PI3K/Akt-p27信号通路,抑制Akt活性,使p-Akt表达减少,下游的p27表达水平增加,从而使细胞在G1/G0期占比增加,G2/M所占比例减少,细胞周期减慢,最后抑制肝癌细胞的增殖。