繁殖性状是影响养猪生产的重要经济性状之一,其中产仔数是衡量母猪繁殖性状的一个重要指标。提高产仔数的关键在于降低猪胚胎/胎儿死亡率,提高胎儿存活率。而胚胎死亡绝大多数发生在胚胎附植前或附植期间,因此胚胎附植是影响母猪产仔数的关键时期。有研究表明转录因子HOXA10基因(同源异形框A10基因)受雌激素、孕激素调控,高表达于着床窗口期,对胚胎附植的建立、妊娠的维持等具有重要作用。通过转基因技术制备特定时期在特异组织中高表达HOXA10基因的转基因动物,降低胚胎死亡,提高产仔数是我们努力的目标。本研究通过转基因小鼠模型积累实验数据,为制备高繁殖力转基因猪奠定基础;通过转基因克隆技术,以期获得高繁殖潜力的转基因克隆猪,获取新的科研材料;深入了解HOXA10基因在胚胎发育和附植过程中的调控机理,对于提高母猪产仔数具有重要的理论和实践意义。本研究主要研究结果如下:1.采用显微注射法制备转HOXA10基因小鼠,通过Southern及外源插入片段的全长扩增对G0代阳性小鼠进行鉴定。对G2代阳性小鼠的各组织中Hoxa10基因的表达进行检测,发现在肾脏、膀胱和子宫内膜组织中有表达,在心脏、脾脏和卵巢中有痕量表达。G2代母鼠腹腔注射雌激素、孕激素来诱导Hoxa10基因表达,使用Q-PCR及Western blot检测Hoxa10表达的差异,并用Q-PCR检测受Hoxa10调控的下游基因:ETA(内皮素受体A)和Phgdh(磷酸甘油酸脱氢酶),发现这些基因在转基因小鼠和非转基因小鼠中的表达具有差异。统计分析经产胎次的G2代小鼠产仔数,发现转基因小鼠比非转基因小鼠提高产仔数约1只(P=0.08),可以认为转HOXA10基因小鼠的产仔数有增加的趋势。2.对实验室前期获得的6头G0代转HOXA10基因克隆公猪进行传代,产生了56头G1代小猪,经检测有25头为阳性,其中11头雌性。检测G0代转基因克隆公猪12个组织中HOXA10的表达情况。结果显示:HOXA10基因在肾脏、大肠和膀胱中的表达较高;肌肉和淋巴有微弱表达;心脏、肝脏、脾脏、肺脏、脂肪、小肠和睾丸中未检测到表达。3.对4头G0代转基因克隆公猪及部分G1代猪(阳性和阴性)进行血液生理生化指标测定,发现G0代转基因克隆公猪及G1代公猪(阳性与阴性)血小板数目均低于非转基因公猪和文献报道的血小板数目。生化指标中,G0代转基因克隆公猪的睾酮含量低于非转基因公猪,其它指标没有发现异常。4.通过对猪胎儿成纤维细胞进行性别鉴定、脂质体介导转染pc3.1-PF3-HOXA10表达载体、G418筛选、单克隆挑选、PCR检测,建立了4株稳定转染HOXA10的阳性细胞系。5.利用胚胎移植技术,核移植其中1株生长状态较好的细胞,成功制备了3头转HOXA10基因克隆母猪。采用Q-PCR和染色体步移技术对转基因克隆母猪的外源基因拷贝数及整合位点进行检测,发现3头猪的拷贝数分别为27.70、19.88、25.26,外源片段可能插入到4号、9号、13号、14号染色体上。6.采用Lnc RNA芯片,分析在Ishikawa细胞(子宫内膜癌细胞株)中过表达HOXA10基因后,引起差异表达的m RNA和Lnc RNA。发现过表达HOXA10基因后,有339个m RNA上调表达,568个m RNA下调表达(Fold Change≥2,P<0.05及Q<0.05)。对过表达HOXA10基因后差异表达的m RNA进行GO分析,发现上调表达的m RNA主要参与血管发育、细胞粘附、细胞迁移等生物过程;下调表达的m RNA主要参与细胞周期、胞内运输、蛋白核定位等生物过程。进行KEGG通路分析时,发现差异表达基因主要涉及细胞粘附分子、细胞周期等生物学通路。7.对Lnc RNA进行分析,发现过表达HOXA10基因后,引起732个Lnc RNA上调表达,294个Lnc RNA下调表达(Fold Change≥2,P<0.05及Q<0.05)。对全部Lnc RNA进行亚组分析,共检测到1,514条类似增强子的Lnc RNA,其中有43条上调表达,16条下调表达。在9,987条基因间长链非编码RNA中,有274条上调表达,98条下调表达。通过分析可能与胚胎附植相关的差异表达的m RNA相邻的差异表达的Lnc RNA,来预测与胚胎附植相关的Lnc RNA。