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丙型肝炎病毒(HCV)是一种严重危害人类健康的重要病原体,全球约有1.7亿感染者。HCV感染极易慢性化,可进展为慢性肝炎,肝硬化和肝癌。目前,HCV的感染主要采用以Ⅰ型干扰素(IFN-α)为主的治疗方案。干扰素代表了机体对抗病毒感染的第一道防线,许多基因的表达受IFN的调节。目前已知,蛋白激酶R(PKR)、2-5寡腺苷酸合成酶(2-5 OAS)、载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)等,作用于病毒生活周期的不同阶段,抑制了病毒的入胞、脱衣壳、翻译、RNA的复制以及病毒粒子的包装、成熟、释放。尽管如此,对于大多数干扰素诱导蛋白的抗病毒作用机制,目前仍然不是很清楚。 Viperin(for virus inhibitory Protein,endoplasmic reticulum-associated,interferon-inducible)是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的,在进化上高度保守的干扰素诱导蛋白。2005年,Karla.Helbig等人首次报道了在体外HCV亚基因组复制子(Replicon)系统中,Viperin可以抑制HCV病毒的复制,并且发现在所有检测的慢性HCV感染病人的肝穿标本中Viperin都呈现高水平表达,提示Viperin可能在机体抑制HCV病毒感染中发挥重要作用。本室前期的研究在细胞水平证实Viperin对HCV的抑制作用,在探讨Viperin抑制HCV复制的机制时发现在HEK-293T细胞中Viperin与宿主细胞蛋白h-VAP33存在相互作用,而h-VAP33是文献早已报道的参与HCV复制复合体组成的重要蛋白,为此拟进一步对两者间的相互作用进行深入研究,并探讨这种相互作用对Viperin抑制HCV复制的意义。 本研究首先在支持HCV复制的肝癌细胞系Huh7细胞中验证了Viperin与h-VAP33的相互作用。在Huh7细胞中共转Viperin和h-VAP33,利用免疫共沉淀和荧光共聚焦分析技术,均证实在Huh7细胞中Viperin与h-VAP33存在明显的相互作用。 进一步对Viperin与h-VAP33相互作用的区段进行分析研究。据文献报道Viperin由位于N末端的锌指结构域(Putative Leucine Zip),中部具有潜在SAM酶活性结构域(Radical SAM domain)和C端未知功能结构域(UnknownC-terminal domain)组成。而hVAP-33是一个含有243个氨基酸的蛋白质,包含有N段的主要精蛋白结构域(Major sperm protein domain,MSP),C段的卷曲螺旋结构域(Coiled-coil domain)以及位于最C末端的跨膜域(TMD)。因此分别构建了Viperin与h-VAP33一系列的截短体,利用免疫共沉淀和免疫共聚焦实验分析技术对这些截短体的相互作用情况进行研究。结果显示hVAP-33的C段卷曲螺旋结构域(Coiled-coil domain)与Viperin的C端未知功能结构域(UnknownC-terminal domain)介导了这两个蛋白的相互作用。 由于已有研究报道hVAP-33通过N段的主要精蛋白结构域(Major spermprotein domain,MSP)和C段的卷曲螺旋结构域(Coiled-coil domain)分别与HCV的非结构蛋白NS5B和NS5A相互作用,并将其锚定在ER膜上促进HCV在细胞内的复制,而本研究发现Viperin也通过hVAP-33的C段的卷曲螺旋结构域(Coiled-coil domain)与该蛋白结合,由此推测Viperin通过与NS5A竞争性结合hVAP-33而干扰了NS5A和hVAP-33的相互作用,从而破坏HCV复制复合体的组装而发挥其抗HCV作用。竞争实验结果显示,在Viperin存在的情况下hVAP-33与NS5A的相互作用确实受到显著抑制,而hVAP-33与NS5B的相互作用则没有受到影响。进一步在293T细胞中共转染HA-Viperin-c144、myc-NS5A、flag-hVAP-33以及HA-vector、myc-NS5A、flag-hVAP-33表达质粒,竞争实验结果发现,Viperin的C端未知功能结构域(Unknown C-terminal domain)存在的情况下,即可干扰NS5A和hVAP-33的相互作用。 综上所述,本研究发现Viperin的C端未知功能结构域(Unknown C-terminaldomain)可以与NS5A竞争性结合hVAP-33的C端卷曲螺旋结构域(Coiled-coildomain),干扰NS5A与hVAP-33的相互作用,破坏HCV复制复合体结构的完整性从而抑制HCV的复制。上述结果对于Viperin抑制HCV病毒的复制的机制提出了一种可能的解释,并为在临床上提高干扰素治疗HCV感染的应答率打下了一定的基础。