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结肠癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一,多数病人发现时已属晚期,早期患者接受根治性手术联合辅助治疗,但约半数病人术后仍死于转移和(或)复发。以5FU、伊立替康、奥沙利铂、卡培他滨等为基础的化疗药物疗效达到平台,化疗药天然不敏感或很快耐受,且毒副作用大引起大家关注。因此,寻求低毒高效的天然植物成分成为近几年来结肠癌抗肿瘤药物开发的热点。白藜芦醇(resveratrol)是一种重要的植物抗毒素,广泛存在于葡萄、花生、桑葚中。各项研究显示,白藜芦醇存在抗炎、抗氧化、抗血栓、抗突变等生物活性剂药理作用。同时人们发现白藜芦醇还具有显著的抗肿瘤作用,主要表现为抗细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、干预细胞信号转录、增强抑癌基因活性及抑制癌基因表达。环氧合酶(COX)是催化花生四烯酸生成前列腺素过程中重要的限速酶,其主要产物是前列腺素PGE2,PGD2等。它包含两种亚型:COX-1和COX-2。近年来很多研究围绕COX-2在肿瘤发生发展过程中的作用机制进行,并取得重大进展。研究发现,COX-2与人类上皮来源的恶性肿瘤尤其是消化系统恶性肿瘤有密切的联系,研究表明COX-2在结肠肿瘤中表达增高。在肝癌、乳腺癌等研究中发现白藜芦醇具有较强的抑制COX-2的药理作用,且白藜芦醇能通过抑制COX的环氧合酶活性和氢过氧化物酶活性而在肿瘤促进阶段起抑制作用。目前白藜芦醇抗肿瘤作用在多种肿瘤包括肝癌、乳腺癌、胃癌等体外细胞实验及动物模型上得到证实,但目前白藜芦醇的抗肿瘤作用机制尚不十分明确。因此,有必要研究白藜芦醇对结肠癌的抗肿瘤活性及其相关机制。本研究以人结肠癌SW480细胞株为实验对象,研究白藜芦醇对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及机制,并探讨其抗肿瘤作用与COX-2的关系,以期为其在结肠癌治疗方面提供新的基础理论依据。第一部分白藜芦醇对人肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制探讨目的:体外观察白藜芦醇对SW480肠癌细胞株增殖及细胞周期的影响,并探讨白藜芦醇促进肠癌凋亡的可能相关分子机制。方法:将SW480人肠癌细胞株于37℃、5%CO2条件下进行培养。1、待细胞呈对数生长,接种于96孔培养板,设实验组、空白组、阴性对照组,经不同浓度白藜芦醇(0,10,20,30,50ug/ml)作用不同时间(24h,48h,72h)后应用MTT法检测白藜芦醇对细胞增殖的影响,并计算IC50;2、将细胞接种于6孔板,设置空白对照组、不同浓度给药组,应用流式细胞术检测细胞凋亡周期。3、以RT-PCR法检测不同浓度白藜芦醇作用48h后,细胞凋亡相关基因bcl-2、bcaspase-9和caspase-3 m RNA表达水平的变化。结果:1、MTT比色结果显示:白藜芦醇能明显抑制SW480人肠癌细胞增殖,随着药物浓度(0-50ug/ml)递增及作用时间的延长(24h、48h及72h),其抑制率明显延长,范围为17.4-57.1%,呈显著浓度-时间依赖性。低浓度时(≤10ug/ml),肿瘤抑制作用不显著。相同浓度白藜芦醇作用48h及72h抑制率均比24h高,具有统计学意义(P<0.05)。相同浓度白藜芦醇作用72h抑制率比48h高,无统计学意义。白藜芦醇作用于SW480人肠癌细胞24h、48h及72h的IC50值分别为91.19±0.017ug/ml,32.58±0.022ug/ml及29.49±0.024ug/ml。2、流式细胞术分析结果提示:(1)随着白藜芦醇浓度(0,20,30,50ug/ml)逐渐增大,早期凋亡比例从3.8至15.7%,晚期凋亡所占比例为0.9-32.2%,凋亡细胞总比例从4.7增加至47.9%,呈明显浓度依耐性。(2)不同浓度白藜芦醇作用SW480人肠癌细胞株,S期细胞比例增加,G1期的细胞比例减少,提示白藜芦醇能诱导SW480细胞S期阻滞。3、RT-PCR检测结果显示:随着白藜芦醇浓度(0,20,30,50ug/ml)逐渐增大,bcl-2/GAPDH光密度积分值的比值呈降低的趋势(p﹤0.001);caspase-9/GAPDH及caspase-3/GAPDH各浓度组光密度积分值的比值呈增高的趋势(p﹤0.001)。结论:(1)一定浓度的白藜芦醇作用于对人肠癌SW480细胞具有增殖抑制和促进凋亡的作用,且成时间-浓度依耐性。(2)白藜芦醇诱导SW480细胞S期阻滞,进而诱导细胞凋亡。(3)白藜芦醇作用于肠癌SW480细胞,通过下调Bcl-2基因表达,上调caspase-9及caspase-3基因表达,从而引发细胞色素C-Apaf-1-caspase-9-caspase-3凋亡通路的激活可能是其诱导细胞凋亡的机制之一。第二部分白藜芦醇抗肿瘤作用与COX-2的关系目的:探讨白藜芦醇对SW480肠癌细胞株的抗肿瘤作用与COX-2之间的关系。方法:1、设计三条COX-2 siRNA引物转染SW480人肠癌细胞,采用RT-PCR筛选出最佳的靶向COX-2 si RNA进行后续转染,利用MTT法检测COX-2表达被抑制后细胞增殖的情况。2、Western-Blotting实验:将CCD-18Co正常人结肠细胞及SW480、HT29人肠癌细胞株细胞株于37℃、5%CO2条件下进行培养。呈对数生长后接种到96孔板,利用Western-Blotting检测正常人肠细胞及肠癌细胞COX-2蛋白表达的区别。同一条件下培养SW480人肠癌细胞24h,分别加入不同浓度白藜芦醇(10、20、30及50ug/ml)作用48h,设空白组对照组。利用Western-Blotting检测不同浓度白藜芦醇对肠癌细胞COX-2及PGE2蛋白表达的影响。靶向COX-2 si RNA转染SW480细胞后72h,加入30ug/ml浓度白藜芦醇作用48h。设阴性对照组、药物作用组、单纯转染组及转染后药物作用组。利用Western-Blotting检测白藜芦醇作用于转染后SW480细胞的COX-2蛋白表达的变化。结果:1、经光密度扫描分析显示:COX-2 siRNA转染72 h后,1号、2号及3号COX-2si RNA转染组和空白对照及阴性对照组相比,COX-2/GAPDH光密度积分值的比值均显著降低(P﹤0.05),提示COX-2 si RNA转染后,COX-2m RNA表达受到抑制。其中2号COX-2 si RNA抑制COX-2 m RNA表达作用更强,故以2号序列作为COX-2 RNAi设计作为后续转录实验。2、MTT实验结果提示:与空白对照组及阴性si RNA转染对照组相比,2号COX-2si RNA转染SW480细胞后48h后细胞增殖开始受到抑制,72h细胞增殖抑制明显(P<0.05)。提示COX-2si RNA转染后,SW480细胞增殖受到抑制。3、Western-Blotting实验结果提示:(1)正常人结肠细胞CCD-18Co及人结肠癌细胞SW480、HT29中均表达COX-2蛋白。正常人结肠细胞CCD-18Co的COX-2/β-actin光密度积分值比值低于人结肠癌细胞SW480、HT29,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示COX-2蛋白在结肠癌中的表达高于正常人结肠细胞。(2)随着白藜芦醇浓度递增(0-50ug/ml),COX-2及PGE2与β-actin光密度积分值的比值均逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示随着白藜芦醇作用浓度的提高,SW480细胞COX-2表达及PGE2表达下降,且呈浓度依赖性的。(3)COX-2 si RNA转染组与β-actin光密度积分值的比值较阴性对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。提示COX-2 si RNA转染后可降低COX-2蛋白的表达。白藜芦醇30ug/ml作用于COX-2 si RNA转染组后,其COX-2与β-actin光密度积分值的比值与单纯转染组比较,下降更明显(P<0.05)。进一步提示白藜芦醇作用后能降低SW480细胞COX-2蛋白的表达。结论:(1)结肠癌中COX-2蛋白的表达高于正常人结肠细胞。(2)COX-2与结肠癌细胞的生长密切相关,抑制结肠癌细胞中COX-2表达可抑制结肠癌细胞生长。(3)白藜芦醇对肠癌SW480细胞的生长抑制作用可能与其抑制COX-2及PGE2表达有关。