支气管哮喘是临床上一种以反复发作的喘息、胸闷、呼吸困难和咳嗽等为特征的气道慢性炎症性疾病。其发病率在大部分国家呈逐年上升的趋势。哮喘的发病受遗传因素和环境因素的共同影响。多个研究显示人类染色体5q31～33区域与哮喘相关，该区域受到国际上的广泛关注。Th1／Th2细胞的失衡被认为在哮喘的发病机制中起关键作用。TIM基因家族是一个影响Th细胞分化发育的基因家族—T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白基因家族。人类的TIM家族位于染色体5q33.2，包括3个成员TIM1，TIM3和TIM4。TIM1表达于活化的T细胞表面，在Th2细胞明显多于Th1细胞。TIM3特异性表达于终末期Th1细胞表面，其与受体结合后下调Th1细胞的免疫应答。TIM4主要表达于成熟的树突状细胞，巨噬细胞的膜表面，TIM4与其受体TIM1的结合后，促进Th2细胞的分化与增殖。最近的研究显示增强TIM4的表达会促进Th2细胞的优势分化，并导致一些过敏性反应的发生。因此，TIM4也是哮喘的候选研究基因。已有多篇文献报道了TIM1，TIM3基因多态性与哮喘的相关关系，但在不同的人种中结果不一。Natalie S报道了TIM4的一个主要的单体型在高加索人群中与过敏性鼻炎相关。但TIM4基因多态性与哮喘之间的关系尚不清楚，有待进一步的研究。本课题以“中国汉族哮喘人群TIM4基因多态性的确定，TIM4基因多态性与哮喘的关联研究，TIM4基因变异的功能学探讨”为研究主线，对TIM4基因多态性与哮喘的关系进行了探讨。本研究共分为以下三部分：第一部分中国汉族哮喘人群TIM4基因启动子及外显子区的测序研究目的研究中国汉族哮喘患者T细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白4(T cellimmunoglobulin domain and mucin domain protein 4，TIM4)启动子区，外显子区，3’非翻译区的基因多态性的分布特征及启动子区单体型频率分布。方法采用直接测序法对TIM4启动子区，外显子区，3’非翻译区进行了研究，JLIN软件分析启动子区各位点间的连锁不平衡关系。结果我们在中国汉族哮喘患者的TIM4基因共检测到了6个SNP，分别分布于启动子区和外显子2，外显子9。其中TIM4-1609G＞A，-153 T＞C，43746C＞T为新发现的3个SNP位点，最小等位基因频率分别为0.10，0.15，0.05。rs6874202位点的A等位基因频率在中国汉族哮喘人群高于中国汉族人群(P＜0.05)。rs6874202位点和rs6882076位点的等位基因频率在不同人种之间差异有统计学意义。启动子区的4个SNPs的等位基因呈现连锁不平衡关系。在构成的单体型中，最常见的单体型GGTG的频率为0.630。结论中国汉族TIM4的SNP分布特征与其他人种存在差异。rs6874202位点与哮喘之间可能存在关联。中国汉族哮喘患者TIM4启动子区的4个SNP连锁，存在连锁不平衡关系。第二部分TIM4基因多态性与哮喘及其表型的关联研究目的研究TIM4基因10个SNPs及组成的单体型与哮喘和其表型的相关性。方法采用错配引物PCR限制性内切酶片段多态性的方法对208名哮喘儿童和232名健康对照的rs6874202和rs6882076的多态性进行了检测，比较了等位基因和基因型频率在病例组与对照组之间的差异。采用化学发光法测定了血浆总IgE的含量，并分析了rs6874202和rs6882076与血浆总IgE之间的相关性。采用错配引物PCR限制性内切酶多态性的方法对118个核心家庭的TIM4 new1，rs6874202，TIM4 new2，rs6882076，8579G＞A，rs7724832，rs7700944，rs1345617，rs1345618和TIM4 new3的多态性进行了检测，采用TDT检验分析了它们与哮喘及血浆总IgE之间的相关性。用Haploview软件分析了这些SNP之间的连锁不平衡关系，确定了TIM4的单体型域。用Transmit软件进一步分析了单体型与哮喘之间的关联性。结果rs6874202等位基因及基因型频率在哮喘组与健康对照组间差异有统计学意义(P＜0.01)，A等位基因频率在哮喘组高于正常对照组。家系标本中传递A等位基因的数量明显高于未传递数，也显示rs6874202与哮喘易感性具有关联。其他分型的SNP位点则与哮喘易感性不相关。所检测的SNP多态性位点均与血浆总IgE无相关性。中国汉族的TIM4基因可分为两个Block，Block1中的单体型GGTGGG的频率最高，占64.7％，GACAGG单体型与哮喘易感性呈正相关，GGTAGG单体型与哮喘易感性呈负相关。而Block2的的3种常见单体型与哮喘易感性均不相关。结论rs6874202与哮喘存在关联性，A等位基因的携带者患哮喘的风险是G等位基因携带者的1.91倍。单体型GACAGG与哮喘之间呈正相关，可能增加哮喘的罹患危险。第三部分TIM4启动子活性的荧光素酶报告基因研究目的构建两种含TIM4基因启动子的荧光素酶报告基因载体，研究不同的TIM4基因启动子序列对荧光素酶在16HBE细胞中表达的影响，评价SNPrs6874202对TIM4基因启动子活性的调控。方法采用重叠PCR构建GACA和GGCA单体型PCR产物，定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中。将含不同单体型的TIM4基因启动子的报告载体pGL3-GACA，pGL3-GGCA,及空载体pGL3-Basic瞬时转染16HBE细胞，以pRL-TK为内参照，48小时后检测荧光素酶的相对活性。结果经过酶切鉴定和测序鉴定，证明成功构建了两种含TIM4基因启动子的荧光素酶报告基因载体pGL3-GACA，pGL3-GGCA，仅在一处存在碱基差异。两种报告载体都能在16HBE细胞表达，荧光素酶相对活性明显高于空载体pGL3-Basic。GACA单体型的报告载体的荧光素酶相对活性与GGCA单体型的报告载体存在差异(P＜0.05)，前者是后者的1.45倍。结论成功构建了两种含TIM4基因不同启动子序列的荧光素酶报告基因载体pGL3-GACA，pGL3-GGCA；与G等位基因相比，SNPrs6874202的A等位基因可增加TIM4启动子的转录活性，可能增加哮喘的遗传易感性。