志贺菌属细菌又称痢疾杆菌,是细菌性痢疾(简称菌痢)的病原体。菌痢是全球都存在的一个公共卫生问题,尤其对发展中国家造成重大危害。志贺菌属根据O抗原分为4个群：分别为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌。随着人们对各种抗生素持续广泛的应用,甚至滥用,使志贺菌耐药现象愈发严重,不但影响临床疗效,而且严重增加治疗成本和新药研发成本,并使新药应用于临床的周期缩短。因此,研究志贺菌耐药机制,进而为志贺菌耐药的防治提供科学依据和有效手段,已成为目前的研究热点。插入序列(IS)是可以独立存在的遗传单元,是染色体的特殊组成部分,可以从染色体上的一个位置转移到另一个位置,或在不同染色体间跳跃。最近有学者报道,ISEcpl可能与细菌β-内酰胺类抗生素耐药有关。目的本课题通过药物诱导、基因测序等手段,比较志贺菌敏感株诱导前后ISEcpl与blaCTX-M的位置关系及blaCTX-M的表达的变化,以阐明ISEcp1诱导转座影响细菌耐药的分子机制。并进一步收集志贺菌株进行ISEcp1、blaCTX-M的分布、头孢菌素耐药情况及二者对应关系的分析,从而对所阐明的机制提供现场佐证。方法1.志贺菌的收集、鉴定：从河南、江西收集志贺菌233株,并进行血清、生化鉴定；2.药敏试验：用纸片扩散法测定菌株对所研究抗生素药敏纸片的抑菌环,用琼脂稀释法测定菌株的最低抑菌浓度；3.头孢噻吩次抑菌浓度诱导实验：采用改良K-B法筛选临床分离、鉴定的志贺菌敏感株,用琼脂稀释法测定志贺菌敏感株对头孢噻吩的最低抑菌浓度,采用头孢噻吩次抑菌浓度诱导实验构建志贺菌诱导耐药株；4.全基因组测序分析比较志贺菌敏感株诱导前后差异：Solexa全基因组测序,并利用Clustal等生物学软件进行比较、分析；5. ISEcpl转座及对blaCTX-M表达的影响：通过PCR、克隆和测序分析比较诱导前后ISEcpl与blaCTX-M的位置关系；并将克隆构建质粒转化入感受态细胞DH5α, K-B琼脂法对不同转化子进行药敏试验及超广谱p-内酰胺酶表型确证试验,同时做RT-PCR,阐明ISEcpl诱导转座后对blaCTX-M的表达的影响；6. ISEcpl与blaCTX-M的分布及菌株耐药情况：PCR检测所收集志贺菌的ISEcpl与blaCTX-M,K-B实验进行头孢菌素耐药性检测,将耐药情况与所检测目的基因进行对应分析。结果1.对志贺菌敏感株mel-sf1998023/zz进行头孢噻吩次抑菌浓度诱导,最终得到诱导后头孢噻吩MIC为512mg/L,是诱导前出发菌株的32倍。2.头孢噻吩诱导志贺菌敏感株mel-sf1998023/zz的前后,不但对头孢噻吩的耐药性发生了改变,同时测得诱导后菌株对头孢唑啉、头孢呋辛钠、头孢噻肟、头孢他啶、头孢毗肟均由敏感转变为耐药。3.头孢噻吩诱导志贺菌敏感株使其耐药后,基因组序列发生了改变,不但有SNV,还造成了新的插入和缺失,且诱导前后菌株插入序列的拷贝数发生了变化。4.通过比较志贺菌出发敏感株与诱导耐药株的KEGG代谢通路发现诱导耐药株比出发敏感株多一个代谢通路ko00930:Caprolactam degradation,即己内酰胺代谢通路。5.志贺菌被头孢噻吩诱导后,ISEcpl转座插入到blaCTX-M上游,且诱导后的志贺菌较诱导前对多种头孢菌素耐药水平显著提高。6.成功获得重组质粒pCTX、pISECTX,并将它们与pMD19-T空载体分别转入DH5α感受态细胞,获得DH5α(pCTX)、DH5α(pISECTX)、DH5α(T)转化子。对DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)插入序列测序发现该blaCTX-M基因为blaCTX-M-55,其上游是ISEcpl含-35区和-10区启动子位点。7. DH5α(pISECTX)克隆株blaCTX-M基因表达的相对含量显著高于DH5α(pCTX)的相对含量。8. DH5α(pISECTX)较DH5α(pCTX)对下列头孢菌素均从不耐药到耐药,包括头孢噻吩、头孢呋辛钠、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松,对头孢吡肟虽没达到耐药水平,但DH5α(pISECTX)较DH5α(pCTX)对头孢吡肟的最低抑菌浓度提高了32倍。9.对DH5α(T)、DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)进行ESBLs表型确证试验,判定只有DH5α(pISECTX)产ESBLs。10.233株志贺菌株中,对头孢噻吩、头孢唑啉耐药检出率较高分别为35.2%和28.3%,对头孢呋辛钠耐药检出率为13.7%,对抗生素头孢噻肟的耐药检出率12.9%高于头孢他啶9.0%,对头孢吡肟的耐药检出率最低,为5.2%。共有92株对1种或1种以上头孢菌素产生耐药。志贺菌耐药谱型分析显示,志贺菌对6种头孢菌素的耐药谱型有24种。最常见的头孢菌素耐药谱型是头孢噻吩、头孢唑啉占35.87%。11.1998～2001年及2003～2008年志贺菌头孢呋辛钠、头孢噻肟的耐药检出率有逐年上升的趋势。同时期,志贺菌ISEcp1和blaCTX-M的携带率也有逐年上升的趋势。12.志贺菌中基因标记分布情况：1) ISEcp1阳性组志贺菌对头孢噻吩、头孢唑啉、头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于ISEcp1阴性组志贺菌。2) blaCTX-M阳性组志贺菌对头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于blaCTX-M阴性组志贺菌。3) ISECTX片段阳性组志贺菌对头孢噻吩、头孢唑啉、头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于ISECTX片段阴性组志贺菌。结论1.在持续的小剂量头孢噻吩药物的作用下,志贺菌对头孢菌素类抗生素的敏感性能大大降低,甚至产生严重耐药。2.头孢噻吩诱导敏感志贺菌前后基因组序列发生改变,且诱导耐药株比出发敏感株多一个己内酰胺代谢通路,此代谢通路可能与诱导耐药有关。3.在外界头孢菌素压力下,ISEcp1可转座插入到blaCTX-M上游,为blaCTX-M表达提供所需要的启动子,使其高表达导致细菌对各种头孢菌素耐药。4.1998～2001年及2003～2008年志贺菌头孢呋辛钠、头孢噻肟的耐药检出率逐年上升的同时伴有ISEcp1和blaCTX-M的携带率逐年上升。5. ISEcpl和blaCTX-M与头孢菌素耐药有关,且若ISEcpl位于blaCTX-M上游头孢菌素耐药检出率较高。