论文部分内容阅读
霍乱是一种烈性肠道传染病,是我国的甲类传染病,可导致中毒脱水性腹泻,死亡率高。霍乱弧菌的致病基因主要包括：1、CTX基因元件,其中ctxAB基因编码霍乱肠毒素,作用于小肠粘膜,引起大量肠液分泌导致腹泻。Zot基因编码的小带连结毒素增加小肠粘膜的渗性,对霍乱弧菌引起的腹泻起辅助作用。ace基因编码的辅助霍乱肠毒素可以引起肠腔积液；2、致病性岛(V.cholerae pathogenicity island, VPI),霍乱弧菌的VPI长约40kb,其中的tcpA基因编码TCP菌毛,该菌毛是霍乱弧菌的肠道定居因子,也是CTXΦ的受体；3、toxR基因,是一个基本的毒力调节基因,编码CT和TCP的基因都由toxR基因调控。霍乱弧菌的致病性是由以上几个致病因子共同作用引起。随着霍乱流行时间的延续,在防治霍乱过程中各种防治药物的不断增加、某些地区的不合理用药以及临床抗生素的广泛使用使得霍乱菌株的耐药性逐渐出现并增加,对各类抗生素耐药加剧,因此霍乱弧菌多重耐药株不断出现。本课题旨在对1962年至2011年上海市222株01/0139群霍乱弧菌进行霍乱毒素基因(ctxA)和毒素协调菌毛基因(tcpA)及相关调控基因小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)、溶血素基因(hlyA)、外膜蛋白基因(ompU)和调控蛋白基因(toxR)的毒力及毒力相关基因分析,研究01/0139群霍乱弧菌流行株和非流行株的毒力基因特征差异,分析不同菌株毒力基因的分布和变化。对01/0139群霍乱弧菌进行噬菌体-生物分型、药物敏感试验,比较上海市不同年代霍乱弧菌的流行趋势和优势菌型,了解霍乱弧菌的耐药性特征和耐药谱变化。同时对01/0139群霍乱弧菌进行PFGE分型和MLST分型分析,研究1962-2011年上海市的01/0139群霍乱弧菌的分子分型特征,分析其菌群结构。采用WHO推荐的改良K-B纸片法,对1962～2011年上海市222株01/0139群霍乱弧菌进行11种抗菌药物(头孢曲松、强力霉素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、丁胺卡那霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、氨苄西林、庆大霉素)敏感试验,分析耐药性特征。以PCR方法检测霍乱毒素基因(ctxA)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)、溶血素基因(hlyA)、毒素协调菌毛基因(tcpA)、外膜蛋白基因(ompU)和调控蛋白基因(toxR)。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对菌株进行分子分型,用BioNumerics软件分析电泳图谱。用多位点序列分析(MLST)方法对霍乱弧菌的七个管家基因(cat、 dnaE、lap、rstR、recA、gyrB、chi)进行扩增、测序、比较,对霍乱弧菌的七个管家基因编号,并根据管家基因的不同组合对霍乱弧菌进行ST分型(sequence typing),用BioNumerics软件分析。222株01/0139群霍乱弧菌经药物敏感试验分析显示,1962-1996年的菌株对多种药物敏感,2005-2011年的菌株对多种药物耐药。0139群霍乱弧菌耐药率明显高于01群,其多重耐药情况严重,0139群产毒株的耐药率比非产毒株高。毒力基因分析显示,1962～1996年O1群病人来源菌株中61.0%(36/59)含有7个毒力基因,2005～2011年O139群病人来源菌株中93.9%(31/33)含有7个毒力基因。1962～1996年水体来源O1群菌株12.0%(3/25)含有ctxA基因,2005～2011年水体来源O1群菌株未检出ctxA基因。O1群霍乱弧菌水产来源菌株以hlyA+toxR+ompU+为主,占25.6%(11/43),O139群霍乱弧菌水产来源菌株以hlyA+toxR+ompU+ctxA+ace+zot+tcpA+为主,占76.1%(16/21)。PFGE分析将222株菌分为121个PFGE型,O139群霍乱弧菌分为3个聚类,O1群霍乱弧菌产毒株及部分非产毒株分为5个聚类。MLST分型将222株菌株共分为84个ST型,其中O139群霍乱弧菌分为3个ST群,O1群霍乱弧菌分为8个ST群。MLST分型显示不同年代的霍乱弧菌产毒株亲缘关系相近,菌群结构比较集中,非产毒株基因组差异大。