脂肪组织是人和哺乳动物主要的储能器官,同时也是重要的内分泌器官,参与机体的糖脂质代谢和内稳态的调节。脂肪组织的发育包括脂肪细胞的生成（adipogenesis）和脂质沉积（lipogenesis）。其中,脂肪细胞的生成经历了由间充质干细胞“定型”成为前脂肪细胞,随后“终末分化”为成熟脂肪细胞的过程。一般认为,以转录因子为核心实现的转录调控,是调控脂肪细胞生成的主要方式。在过去的研究中,鉴定了过氧化物酶体增生子激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）是调控“终末分化”的核心转录因子,并围绕着PPARγ建立了复杂且高度程序化的转录调控网络。目前,参与“终末分化”转录级联已趋于完善,而因为缺乏关键的标志因子,成脂“定型”转录调控网络尚不明晰,还有许多参与早期前脂肪细胞“定型”的转录调控因子未被鉴定。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m⁶A）修饰是真核生物mRNA上最丰富的内部修饰方式。近年来,随着以m⁶A修饰为代表的RNA转录后水平修饰研究的兴起,RNA表观遗传调控在脂肪细胞生成中的作用正越来越受到关注。修饰m⁶A的甲基转移酶、去甲基化酶和识别蛋白通过调控m⁶A修饰影响脂肪细胞生成的功能也相继被发现,但是在这个过程中,m⁶A修饰蛋白本身是如何被调控的?m⁶A修饰变化后调控下游的靶基因有哪些?除m⁶A修饰蛋白外,是否还有其他关键蛋白也通过m⁶A修饰调控脂肪细胞生成?这些问题对于揭示脂肪细胞生成转录后调控的分子机制具有重要作用,值得深入研究。锌指蛋白217（Zinc finger protein217,Zfp217）作为kruppel样锌指家族成员,可以通过转录调控和m⁶A修饰调控多个生物学事件,但在脂肪细胞生成中的调控作用尚不清楚。因此,本研究探讨了Zfp217调控脂肪细胞生成的功能及其发挥作用的分子机制,一方面从转录水平研究Zfp217转录调控的下游靶基因,另一方面基于m⁶A修饰的转录后水平揭示Zfp217发挥调控作用新途径。主要研究内容和结果如下:第一部分Zfp217通过Zfp521调控脂肪细胞“定型”的功能和机制研究为研究Zfp217调控脂肪细胞生成的功能,我们利用过表达质粒、siRNA和CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除实现了Zfp217基因功能的“获得”和“缺失”,研究其对C3H10T1/2间充质干细胞、3T3L1前脂肪细和MEF脂肪细胞生成的影响。随后进一步研究了Zfp217调控脂肪细胞“定型”的机制,通过双报告试验、Chip和挽救试验研究Zfp217对早期定型调控因子Zfp521的转录调控;并研究了Zfp217通过Ezh2对H3K27me3修饰水平的影响。揭示了Zfp217在脂肪细胞生成尤其是早期命运决定中的功能,主要结果如下:1、过表达Zfp217显著促进了C3H10T1/2间充质干细胞和3T3L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化,成脂关键转录因子PPARγ与标志基因Ap2（Fabp4）的mRNA和蛋白表达显著上调;而敲低和敲除Zfp217则显著降低脂肪细胞生成;在活体分离的Zfp217^+/--MEF细胞中也发现,Zfp217抑制的MEF细胞的成脂分化能力显著降低。随后发现,敲除Zfp217显著降低了脂滴表面基因,脂质代谢和转运关键基因的mRNA表达（P<0.01）,过表达则显著促进了相关基因的表达（P<0.01）。表明Zfp217正向调控脂肪细胞生成,并且改变了细胞的内稳态和脂质代谢。2、过表达和干扰Zfp217后,在生长和成脂条件下,均显著改变了Zfp521的mRNA表达变化（P<0.01）。双报告和Chip试验发现Zfp217可以直接结合Zfp521的启动子区域并抑制其活性（P<0.01）;过表达Zfp521之后,Zfp217促进脂肪细胞生成的作用显著降低。表明Zfp521是Zfp217转录调控的直接靶基因。3、利用CoIP和激光共聚焦技术发现了Zfp217和Ezh2的蛋白互作;Chip-QPCR和QPCR结果显示了Zfp217通过Ezh2促进Zfp521启动子区域H3K27me3修饰（P<0.01）和mRNA的表达（P<0.01）;干扰Ezh2后,改变了Zfp217对C3H10T1/2细胞成脂的调控。证明了Zfp217依赖于同Ezh2的蛋白互作,调控Zfp521表达及成脂“定型”。第二部分Zfp217转录调控E4bp4促进前脂肪细胞“终末分化”的机制研究我们还研究了Zfp217调控前脂肪细胞“终末分化”的分子机制,发现了E4bp4是Zfp217下游的靶基因,受到Zfp217的转录调控。随后鉴定了转录因子E4bp4在成脂分化中的调控作用,并发现了E4bp4可以响应糖皮质激素信号,通过转录抑制靶基因Cox2促进成脂分化,此外我们鉴定了E4bp4调控成脂分化的关键结构域为bZIP结构域。综合以上研究结果阐明了Zfp217通过靶基因E4bp4调控前脂肪细胞“终末分化”的机制。主要结果如下:1、敲除Zfp217的3T3L1细胞中E4bp4表达显著降低（P<0.01）,干扰Zfp217显著降低了E4bp4的启动子活性（P<0.01）。以上结果表明Zfp217可以通过调控关键的靶基因E4bp4参与成脂分化的调控。2、QPCR检测发现E4bp4的mRNA水平在3T3L1细胞成脂的早期显著提高;过表达E4bp4显著促进3T3L1细胞的成脂分化,干扰E4bp4则抑制成脂分化;DEX通过GR促进E4bp4的mRNA表达,在缺乏DEX的成脂诱导下,过表达E4bp4部分地恢复3T3L1细胞的成脂分化能力。表明E4bp4参与糖皮质激素介导的成脂分化,发挥正调控作用。3、过表达和干扰E4bp4显著影响Cox2的mRNA表达;启动子截短和挽救试验证明E4bp4通过转录抑制Cox2调控成脂分化;E4bp4缺失bZIP关键结构域,阻止了其促进成脂分化的作用。以上结果表明,E4bp4依赖bZIP结构域通过转录抑制Cox2调控成脂分化。第三部分Zfp217调控m⁶A修饰在转录后水平促进脂肪细胞生成的机制研究为研究Zfp217通过转录后修饰调控脂肪细胞生成的功能和分子机制,本研究首先利用斑点杂交和高效液相色谱-质谱联用检测了抑制Zfp217对3T3L1细胞mRNA m⁶A修饰的影响,随后研究了Zfp217对m⁶A去甲基化酶FTO的调控,并应用高通量测序的技术筛选了Zfp217调控m⁶A修饰下游的靶基因,最后还发现了Zfp217作为功能蛋白质与YTHDF2互作调控m⁶A修饰的新途径。主要结果如下:1、利用斑点杂交和高效液相色谱-质谱联用发现,在突变Zfp217的3T3L1细胞中,以及MEF-Zfp217^+/-细胞中,Zfp217表达的抑制导致mRNA中m⁶A修饰显著增加。说明Zfp217参与调节3T3L1细胞中m⁶A修饰水平。2、3T3L1细胞中干扰Zfp217显著降低FTO基因和蛋白的表达;双报告和启动子删除及Chip-QPCR试验发现Zfp217可以直接结合FTO的启动子区域并促进其启动子活性（P<0.01）;挽救FTO,改变了因干扰Zfp217对m⁶A修饰水平和成脂分化的影响。以上结果表明Zfp217可以通过转录调控FTO维持mRNA m⁶A的低水平,进而促进脂肪细胞生成。3、收集成脂诱导0天和2天的野生型和Zfp217敲除的3T3L1细胞进行了RNA-seq和MeRIP-seq分析。RNA-seq结果显示与WT细胞相比,Zfp217敲除在MDI 0天和2天共同含有1341个上调表达的DEGs和941个下调表达的DEGs;MeRIP-seq分析发现了3332个m⁶A修饰水平升高的DEGs;通过RNA-seq和MeRIP-seq数据联合分析,分别筛选到了376个mRNA上调和16个mRNA下调控且m⁶A修饰水平升高的DEGs;随后筛选了Ccdc141、Hspa1a和Efcab11三个受到Zfp217调控的靶基因,并发现干扰Ccdc141、Hspa1a和Efcab11后,均抑制了3T3L1细胞的成脂分化。4、利用CoIP技术、分离细胞核和细胞质蛋白及利用激光共聚焦拍照,发现Zfp217和YTHDF2蛋白在细胞核和细胞质中均存在,且细胞质的表达量较高,并在3T3L1细胞中存在蛋白互作和共定位;通过斑点杂交、RNA pull down和LSPR发现,Zfp217通过与YTHDF2直接互作,促使FTO与RNA发生结合发挥去甲基化酶作用;干扰YTHDF2,降低了Zfp217靶基因的m⁶A修饰水平（P<0.01）,且恢复了因siRNA干扰Zfp217而造成的3T3L1细胞成脂分化的降低。表明Zfp217与YTHDF2蛋白质直接互作,影响FTO的酶活,参与m⁶A修饰和成脂分化的调控。综上所述,本研究的主要结论是:在脂肪细胞生成过程中,尤其是干细胞早期命运决定过程中,锌指蛋白Zfp217是一个多功能的关键调节因子。在转录水平,Zfp217发挥转录因子的作用,调控了成脂关键基因Zfp521、E4BP4和去甲基化酶FTO等基因的转录,促进了脂肪细胞生成;在转录后水平,Zfp217与识别蛋白YTHDF2直接结合,抑制YTHDF2的活性,降低了mRNA m⁶A甲基化修饰水平,促进了脂肪细胞生成。