目前重金属污染日益严重已经成为全球性关注问题。岩石裸露、火山爆发等地质成因以及燃料燃烧、工业排放、汽车尾气、污水排放等人类活动使重金属释放到环境中。镉广泛分布在环境中,在20种危险物中排名第七。由于重金属镉很难降解且具有相对移动性,排放到陆地和海洋生态系统中的镉可以通过食物链进入人体,对人类的生命安全造成威胁。对于大多数生物来说,长期暴露于高镉环境中会产生致癌、诱变、致畸等严重后果。最近有相关报道说镉可以诱发人类肺腺癌上皮细胞发生早期炎症反应。镉在植物体内积累可影响植物的光合作用、呼吸作用、气体交换、营养运输、抗氧化系统等,从而造成植物叶片皱缩失绿,根部褐化,生长停滞,最后使植物凋亡。叶绿体是镉敏感的细胞器之一。在镉胁迫下,叶绿体结构会发生很大的改变,叶绿体中的分子和新陈代谢也会受到严重影响。例如在镉的影响下,光合作用、电子传递链以及参与光合作用的酶都会受到伤害,从而产生活性氧反应(ROS)。在藻类植物中,镉可以抑制光合系统Ⅱ(PSⅡ)的光活化,产生光合速率、呼吸速率降低等不良反应。因此在植物叶绿体中超表达金属结合蛋白来降低金属毒性随之增强植物抗性是解决重金属对植物伤害的有效方法之一。典型的原核生物携带一系列金属调控蛋白,它们可以直接与金属结合从而保持金属离子的平衡。这些金属调控蛋白可以有选择性的应答一种或一小组相互关联的金属。MerR家族是原核生物中一类主要的金属调控蛋白,CadR是其中的一员,可以感应Cd,对细菌Cd解毒过程有重要作用。cadR编码147个氨基酸,含有三个保守的金属结合位点(Cys77,Cys112,Cys119),N端含有螺旋-转角-螺旋的结构,C端有一段富组氨酸序列,可能与其特异结合镉有关。为了减少镉对叶绿体的伤害,运用分子生物学手段将金属结合蛋白特异表达在叶绿体中,通过改良叶绿体对镉的耐受和积累来提高整个植株的抗性以及镉的积累。cadR是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中调控基因特异与Cd结合的调控因子,对降低镉对细菌的毒害起着重要作用。为了证明Cd特异的cadR可以提高植物的Cd积累和Cd抗性,本研究中将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)cadR异源表达在植物中。将cadR表达在模式植物拟南芥的细胞质中或叶绿体中。比较细胞质和叶绿体定位的CadR转基因拟南芥的Cd积累和Cd抗性。我们发现叶绿体定位的CadR转基因拟南芥可以积累更多的Cd并且Cd抗性更强。更重要的是,CadR转基因拟南芥专一抗Cd,对其他二价金属离子几乎不抗。主要结果如下:(1)cadR转基因拟南芥的亚细胞定位及叶绿体靶向表达我们在CadR上游连接了一个转运肽,使其定位在拟南芥质体中,并用CAB2启动子使CadR特异在地上部分表达。用激光共聚焦显微镜观察CadR的亚细胞定位发现,p35S::cadR-GFP(细胞质定位)和p35S::TP-cadR-GFP(质体定位)的地上和地下部分都能看到荧光,而p CAB2::TP-cadR-GFP(叶绿体定位)只能在地上部分的叶绿体中看到荧光。(2)CadR的表达增强了转基因拟南芥的镉抗性在镉胁迫下,cadR转基因拟南芥的根长大于野生型。例如,在25μM Cd下,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥的根长平均增加了54%。在25、50、100μM Cd下,转基因拟南芥与野生型的鲜重无差异,但在75μM Cd下,与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥的鲜重增加了27%–57%。(3)cadR转基因拟南芥的Cd积累增加Cd处理2天后,与野生型相比,转基因拟南芥根中的Cd含量显著增加(最高达到2倍)。Cd处理7天后,转基因拟南芥和野生型的根和叶中的Cd含量均增加,并无差异。Cd处理16天后,与野生型相比,转基因拟南芥根和叶中的Cd含量均显著增加。我们也测定了单株拟南芥根和地上部分中Cd含量。7天和16天Cd处理下,转基因拟南芥地上部分和根中的Cd含量显著高于野生型(地上部分高达3.5倍,根中高达5.1倍)。(4)转基因拟南芥中Cd对营养元素积累的影响16天Cd处理后,定量分析野生型和转基因拟南芥中的大量元素(Ca、K、P、S、Na、Mg)和微量元素(Mn、Zn、Cu、Fe)。我们发现,转基因拟南芥根和叶中的Mn含量显著高于野生型(叶中高达2.5倍,根中高达3.0倍)。转基因拟南芥茎生叶和茎中的Mn含量是野生型的0.7–2.0倍。转基因拟南芥根中其他金属离子的积累比野生型略低。(5)cadR的表达对叶绿素和类胡萝卜素的影响在100μM Cd处理下,所有植株中叶绿素b的含量显著下降。但cadR转基因拟南芥中的叶绿素b含量下降的少,p35S::cadR、p35S::TP-cadR、p CAB2::TP-cadR三种转基因拟南芥的叶绿素b含量分别比野生型高1.6倍、4.1倍、3.9倍。100μM Cd处理后,p35S::cadR转基因拟南芥中的类胡萝卜素显著下降,但p35S::TP-cadR、p CAB2::TP-cadR转基因拟南芥和野生型中的类胡萝卜素相当。(6)对其他二价离子的应答在其他二价金属离子(如Mn、Hg、Pb、Cu、Zn)胁迫下,所有转基因拟南芥的生长表型与野生型并无差异。