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背景：早在1997年,Asahara等第一次报道了内皮祖细胞(EPCs)参与动物缺血组织中的血管新生；EPCs属于造血干细胞的一个亚群,可以在体内外分化为成熟的内皮细胞,并参与血管的新生,EPCs在血管新生、伤口愈合、缺血损伤、肿瘤生长等生理和病理过程中发挥关键作用。循环血EPCs归巢到血管新生部位并在原位分化为内皮细胞,这个过程称之为出生后的血管发生。骨髓起源的CD34+细胞包含内皮祖细胞(EPCs)、内皮细胞(EC)以及造血干细胞,CD34+细胞作为内皮祖细胞和内皮细胞的来源参与组织损伤的血管新生,实验证实移植CD34+细胞改善缺血性心脏病心肌功能并增加心肌血管新生,同时CD34+细胞可以归巢到卒中脑组织区域,可是关于脑创伤后CD34+细胞的变化及与创伤脑组织修复的关系却暂无报道。最近的报道提示：EPCs被移植到实验动物的下肢和心脏缺血模型后具有相应的治疗效果,这为EPCs的临床应用奠定了基础。目的1.大鼠外周血中内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定；2.观察脑创伤后大鼠外周血CD34+细胞动员与创伤区脑组织血管新生和修复的关系。3.探讨大鼠脑创伤后损伤组织中血管新生与神经新生的相关性。方法1.采集大鼠外周静脉血,采用密度梯度离心法分离外周血中的单个核细胞(MNCs),在包被人纤维连接蛋白(hFN)的培养皿内接种至EGM-2培养基,于37℃、5%CO2培养箱中进行培养；培养2天后经换液去除未贴壁细胞,以后每3天换液1次,倒置相差荧光显微镜下动态观察培养细胞的形态变化特征。借助免疫荧光技术检测培养细胞CD34、CD133、Ⅷ因子(vWF)等内皮祖细胞系列标志的表达；并通过硫氰酸荧光素标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)摄取试验和荆豆凝集素(FITC-UEA-1)结合实验,进行内皮祖细胞功能鉴定。体外培养至第7天,采用流式细胞仪检测CD34+CD133双荧光标记阳性细胞所占比率和CD34单荧光标记阳性细胞所占比率。2.本部分取雄性Wistar大鼠98只,随机分为创伤组和假手术组,每组49只,各组分为7个亚组(每组7只),大鼠制作液压脑创伤模型成功后,各将一个亚组分别于伤前、伤后24,48,72,120,and 168小时,取外周血测CD34+阳性细胞数。创伤组和假手术组分别于术前和术后1,3,7,14,21天处死一个亚组(7只),取脑行CD34免疫组化染色,研究血管新生,进一步探索内皮祖细胞和新生血管的关系。3.本部分取雄性Wistar大鼠42只,随机分为假手术组和创伤组各21只,创伤后3、7天14天假手术组和创伤组分别随机抽取7只大鼠,处死后取脑行脑组织切片免疫组化染色检测齿状回Brdu+细胞和Brdu/Neun+细胞数；取实验第二部分大鼠脑切片行免疫组化染色检测CD34和CD31阳性细胞数,探讨大鼠实验性脑创伤后血管新生和神经新生的相关性。结果1.内皮祖细胞经体外培养第2天细胞贴壁,第五天形成出现细胞克隆样集落,集落周围有内皮样细胞,培养细胞表达CD133、CD34、vWF等内皮祖细胞标志,表明具有内皮祖细胞特征。倒置相差荧光显微镜下观察显示胞质和胞膜呈绿色和红色双色荧光,说明内皮祖细胞能特异性吸附异DiI-ac-LDL和结合FITC-UEA-1,具有内皮细胞功能。体外培养至第7天,流式细胞仪检测CD34单荧光标记阳性细胞所占比率为85.4%,CD34+CD133双荧光标记阳性细胞所占比率为36.5%。2.与假手术组相比较,大鼠脑创伤后循环中CD34+细胞数量显著增加,大鼠脑创伤区CD34+细胞显著增加,伤后创伤区周围及伤侧海马DG各时间点CD34+数于伤后7天达到峰值,随后有所下降；创伤区血管新生显著增加,循环CD34+细胞和脑创伤后血管新生密切相关。3.与假手术组相比较,脑创伤组伤侧海马DG各时间点BrdU+细胞、Brdu/Neun+细胞较假手术组明显增加；脑创伤后创伤区及伤侧海马DG各时间点CD34+、CD31+细胞和MVD均高于假手术组。相关分析显示：血管新生和神经新生密切相关。结论1.可以从大鼠外周血中分离和培养血管内皮祖细胞,为内皮祖细胞研究提供基础。2.脑创伤后大鼠外周CD34+细胞动员,循环CD34+细胞和脑创伤后血管新生密切相关。3.脑创伤后创伤组大鼠血管新生和神经细胞新生均显著增加,血管新生和神经新生密切相关,提示二者共同参与创伤组织的修复。