论文部分内容阅读
罗非鱼广泛分布于热带、亚热带的淡水和咸淡水水域,具有肉质细嫩、生长快速、繁殖力强等特点,1976年被联合国粮农组织作为优良品种向全世界推广养殖。然而自2008年以来,无乳链球菌病(Streptococcus agalactiae)每年都会给我国的罗非鱼养殖业造成巨大的经济损失。目前,该病尚无有效的防治措施。拮抗菌可通过与病原菌竞争性粘附到水产动物体表及与外界相通的腔道,抑制病原菌对水产动物的粘附作用,从而阻断病原菌对宿主的侵袭,达到预防疾病的目的。因此,本文通过优化检测条件,建立了检测无乳链球菌的间接ELISA方法,进而研究了无乳链球菌对罗非鱼粘液的粘附特性,以及无乳链球菌对罗非鱼体表、鳃及肠道粘液的粘附情况,利用从不同环境中筛选得到的59株无乳链球菌拮抗菌,研究了拮抗菌通过竞争、置换和排斥作用对无乳链球菌粘附罗非鱼不同部位粘液的拮抗效果,最后结合安全性试验从中筛选到2株对无乳链球菌具有显著拮抗粘附作用的菌株,具体研究结果如下：本文建立的检测无乳链球菌的间接ELISA试验方法最适条件如下：利用10%的小牛血清封闭作用60min,1：100的一抗浓度37℃条件下作用1h,1：2000的二抗浓度作用60min,37℃显色20min,该检测方法对无乳链球菌的最低作用浓度为1×104CFU/mL。利用建立的间接ELISA方法研究无乳链球菌对罗非鱼不同部位粘液的粘附特性,结果表明：无乳链球菌在菌液浓度为1×107CFU/mL, pH值在7-8,35℃-40℃作用120min时的粘附效果最好,其中对肠道粘液的粘附能力最强,达至4.052×107CFU/mL,其次是体表粘液6.480×106CFU/mL,对鳃粘液的粘附能力最差为2.825×106CFU/mL。本文采用径向扩散法筛选对罗非鱼致病性无乳链球菌具有拮抗作用的益生菌,利用16S rDNA对拮抗菌进行鉴定,构建系统发育树对拮抗菌的多样性进行分析,并通过腹腔注射法测定其对罗非鱼的安全性。结果表明,从8个采样点共分离细菌1759株,其中59株对无乳链球菌具有较强的拮抗作用,抑菌圈直径为10.6mm-30.8mm,平均21.9mm;16S rDNA分子鉴定及系统进化树分析显示,59株拮抗菌分为5属8个种,其中芽孢杆菌属(Bacillus)45株、假单胞菌属(Pseudomonas)5株、肠球菌属(Enterococcus)2株、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)2株和葡萄球菌属(Staphylococcus)5株。鱼体安全性试验显示,其中22株拮抗菌对罗非鱼不具有致病性,可作为防治罗非鱼无乳链球菌病的备选菌株。利用拮抗粘附试验研究59株拮抗菌对无乳链球菌粘附罗非鱼不同部位粘液的抑制作用,结果表明：不同拮抗菌对无乳链球菌粘附罗非鱼不同部位粘液的拮抗作用方式各不相同：在罗非鱼相同部位的粘液中,同一拮抗菌的三种粘附抑制作用强度可能各有不同；在罗非鱼不同部位的粘液中,同一拮抗菌的某种特定粘附抑制作用也通常显示出不同的强度。结合所有实验结果,本文最终从59株拮抗菌中筛选到了HAINUP40、HAINUP96共2株可通过不同的方式抑制无乳链球菌对罗非鱼不同部位粘液的粘附作用的拮抗菌,这两株拮抗菌对罗非鱼是安全的,致死率为O%,对无乳链球菌的抑菌圈直径分别为28.4±0.2mmm和22.2±0.4mmm,分子鉴定显示这两株拮抗菌分别为枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis),为日后罗非鱼无乳链球菌病的防治提供了理论依据。