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蜂胶是西方蜜蜂(Apis mellifera L.)的工蜂通过采集某一或多种植物树脂并和上颚腺、蜡腺等分泌物混合而成的粘性物质。蜂胶的成分复杂多样,到目前为止,蜂胶中已有20多类、600多种化学成分被鉴定出。研究报道蜂胶因其具有的抗炎、抑菌、抗氧化、增强免疫力、保护肝脏等多种生物活性而被广泛应用。乳腺炎是一种由多种因素引起的重要疾病,严重影响了乳品行业的发展,至今尚未有彻底解决的办法。LPS是大肠杆菌细胞壁的主要成分,进入机体后可引起免疫刺激的级联反应和机体的毒性病理生理活动,激活NF-κB、MAPK等信号通路,进而释放炎症因子诱导炎症产生。研究表明蜂胶对乳腺炎致病菌有较好的杀灭作用,此外作为佐剂可以增强疫苗的免疫作用,并且一些研究将蜂胶用于制作乳腺擦剂和乳头保护膜来抵御乳腺炎。本文的主要目的在于通过体内、外实验探究蜂胶对由LPS诱导的乳腺炎作用,研究主要内容及结果如下:(1)中国蜂胶乙醇提取物(EECP)成分分析:采用福林酚法和硝酸铝法分别对EECP进行总酚酸总黄酮含量测定。结果显示,总酚酸的含量为106.35 mg没食子酸当量(GAE)/g、总黄酮的含量为320.85 mg芦丁当量(RE)/g;采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪(UHPLC-QQQ-LC/MC)对EECP中主要的17种酚酸黄酮类化合物精确含量,其中含量最高的化合物分别为:松属素(8.56±0.27μg/mg)、短叶松素(8.52±0.25μg/mg)、高良姜素(12.88±0.57μg/mg)和短叶松素三乙酸酯(12.93±0.59μg/mg)。(2)EECP对MAC-T细胞安全浓度筛选和对LPS刺激下细胞活力的影响:选用0μg/m L、2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、15μg/m L、20μg/m L的EECP处理细胞24 h后,利用CCK-8细胞活力测定试剂盒评估得出EECP对MAC-T细胞安全浓度范围为0-15μg/m L。在加入0-15μg/m L的EECP预处理细胞2 h后,经1μg/m L的LPS刺激24 h后测定细胞活力。与对照组相比,LPS模型组显著降低了MAC-T细胞的活力(P<0.05),而0-15μg/m L的EECP能够有效提高MAC-T细胞的细胞活力。结果表明,EECP对LPS刺激下MAC-T细胞损伤具有保护作用。(3)EECP对LPS诱导的MAC-T细胞炎症模型转录组数据分析:利用RNA-seq技术,对LPS组和EECP+LPS组细胞进行转录组比较分析,从转录水平评估EECP对LPS诱导的MAC-T细胞炎症的作用。基因表达谱显示,同LPS组相比,有2490个基因在EECP处理组中显著差异表达,其中1130个基因上调表达、1360个基因下调表达。DEGs中与炎症和免疫相关的基因检测到有79个,上调基因有31个,下调基因有48个。此外,DEGs富集在细胞过程、生物调控、细胞组分、结合活性等GO term上的基因最多;KEGG通路分析显示DEGs主要富集在细胞应激反应丝裂原活化蛋激酶信号通路、炎症相关IL-17信号通路、细胞生长相关Fox O信号通路和细胞凋亡相关p53信号通路。(4)EECP对LPS诱导MAC-T细胞炎症模型的抗炎作用研究:基于转录组分析结果,我们进一步利用RT-q PCR技术对炎症相关因子以及紧密连接基因表达水平进行检测。结果表明EECP能够抑制LPS诱导的IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-a等因子m RNA的转录水平,提高紧密连接蛋白基因(occludin、ZO-1)m RNA的转录水平。细胞免疫荧光和免疫印迹结果均表明,EECP可增强细胞膜上紧密连接蛋白(occludin、ZO-1)的分布和表达。此外,免疫印迹结果还显示,EECP能降低p-P65、p-Ikbα、p-JNK的表达量,抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活。(5)EECP对LPS诱导小鼠乳腺炎性损伤的作用研究:采用乳头管灌注LPS诱导小鼠乳腺炎模型,评估EECP的体内抗乳腺炎活性。试验分别分为空白对照组、模型组(LPS,1 mg/kg)、EECP试验组(100 mg/kg)和阳性对照组(DEX,5 mg/kg)。母鼠分娩后,连续灌胃EECP或阳性对照七天后,经第四、五对乳头管注射1 mg/kg的LPS,24 h后处死,诱导小鼠急性乳腺炎模型。将采集的样本经HE染色,ELISA法检测炎症因子,RT-q PCR检测紧密连接蛋白基因的m RNA转录水平,并对乳腺组织进行免疫组织化学分析。结果表明,一周规律灌胃EECP能够减少LPS刺激下炎性细胞的浸润、缓解乳腺腺泡结构损伤,抑制小鼠乳腺组织中IL-1β、IL-6、IL-10等细胞炎症因子的过量表达,提高紧密连接蛋白occludin、cluadin-1、ZO-1m RNA的转录水平,并提升紧密连接蛋白occludin、ZO-1在乳腺组织细胞膜上的表达。综上所述,EECP对细菌脂多糖诱导的乳腺炎具有良好的保护作用,这为利用中国蜂胶预防乳腺炎疾病的临床应用提供了试验基础。