如所周知,变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者的主要临床症状(鼻痒、鼻塞、发作性喷嚏和水样清涕)呈现出~24h昼夜节律变化的特点,常常于夜间加重、清晨发作(morning attacks)。传统单一免疫机制无法完全解释这一现象。新近研究表明,生物钟(circadian clock)能够调控鼻腔黏膜组织的周期性活动,进而影响鼻部症状的节律性反应。然而,有关时钟基因(clock genes)与AR发病中时相反应(phase response)的内在作用机制,目前尚不清楚。2017年的诺贝尔生理或医学奖授予3位美国科学奖,以此奖励他们在“时间学”领域做出的突出贡献。这一研究成果揭示了生物钟对机体正常生理活动(睡眠-觉醒周期、激素水平变化、体温昼夜波动)和病理反应(食道过敏反应)具有重要的调控作用。大量研究数据显示,位于下丘脑前部的视交叉上核(suprachiasmatic nuclei,SCN)是昼夜节律振荡(oscillation)的中枢性“母钟”(central clock),负责调控生命体的整体生物节律(circadian rhythm)。在自然条件下,外界光照通过视网膜作用于SCN,启动下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamus-pituitarium-adrenal gland axis,HPA轴)分泌糖皮质激素(glococorticoid,GC)的节律性反应,从而“同步”(synchronization)体内诸如肥大细胞(mast cell,MC)、嗜酸粒细胞(eosinophils,EOS)等多个外周性“子钟”(peripheral clock)时钟基因的周期性表达。也就是说,这种“上下联动”的节律效应可能是通过一系列时钟基因(包括Clock,Period,Cryptochrome在内)的协调性活动完成的。研究已经证实,生物钟节律影响Ig E/MC介导的I型变态反应,且在小鼠皮肤(Passive cutaneous anaphylactic reaction,PCA)模型中得到验证。时钟基因Period(Per)作为生物钟周期反馈环路中最重要的负性调控元件之一,在炎症性免疫反应中具有重要的作用。最新研究表明,内源性GC能够“同步”(synchronization)并重设(resetting)小鼠鼻黏膜组织中时钟基因Per2的节律性表达,然而,有关HPA轴、时钟基因Per2与AR周期性发作的交互关系,目前仍未明确。动物实验研究结果表明,小鼠血清中内源性GC的浓度具有明显的昼夜波动,于夜间活动时相(ZT12~ZT16时)升高,于白昼睡眠时相(ZT0~ZT4时)降低。而小鼠鼻黏膜组织中时钟基因Per2与内源性GC呈现相似的时间性波动趋势,即在ZT12时,两者均显示高表达,在ZT0时,两者均显示低表达。以上研究结果进一步表明,内源性GC扮演“授时因子”(Zeitheber,意为timegiver)的重要作用,可能通过协同时钟基因Per2的周期性表达从而影响AR中鼻过敏症状的时间性发作。但是,时钟基因Per2究竟如何调控AR发病的免疫反应,仍需进行下一步研究。多年来,我们团队一直致力于探究AR发病的神经-免疫作用机制,基于大量的文献追踪以及我们前期的预实验结果,本次课题重点聚焦于探究AR发病的神经-免疫-内分泌机制,具体为时钟基因调控AR鼻过敏症状昼夜时相反应的作用机制研究。初期实验研究首先按照以下“三部曲”进行:(1)通过肾上腺切除术(adrenalectomy,ADX)阻断HPA轴,建立单侧和双侧肾上腺切除的AR小鼠模型,探讨ADX对AR造模及造模后Th1/Th2免疫平衡、调节性T细胞(Treg细胞)反应的影响,初步验证神经-内分泌轴在AR发病中具有重要作用;(2)根据内源性GC分泌的峰谷时间,分别选择ZT4和ZT16时进行OVA致敏与激发,重点探究时钟基因Per2调控AR小鼠鼻过敏时相反应的信号作用机制;(3)通过改变光照周期制备生物钟节律紊乱(circadian rhythm disruption,CRD)小鼠模型,在实验条件下“模拟”人类由于时差变化导致的CRD,重点探究CRD对AR发病中局部(鼻黏膜)和全身(脾脏)免疫反应的影响,以期为AR的临床治疗提供指导。第一部分:内源性糖皮质激素对小鼠变应性鼻炎免疫反应的影响目的:通过建立肾上腺切除(adrenalectomy,ADX)小鼠模型,初步探讨下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA轴)紊乱对小鼠变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)发病中免疫机制的影响,进一步研究AR的神经内分泌调控机制。方法:参照文献进行ADX和AR小鼠造模,将80只ICR小鼠数字表法随机分为空白对照组、AR模型组(未切除肾上腺)、双侧ADX/AR组和单侧ADX/AR组,每组20只。苏木精-伊红(HE)染色鉴定肾上腺组织,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组小鼠血清促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)和皮质醇(cortisol,CORT)的浓度以判定ADX模型。采用症状学评分、卵清蛋白特异性Ig E(OVA-s Ig E)含量以及鼻黏膜嗜酸粒细胞和肥大细胞计数评估AR模型。流式细胞术检测外周血CD4+IL-4+T淋巴细胞(Th2细胞)、CD4+IFN-γ+T淋巴细胞(Th1细胞)表达率及脾脏CD4+CD25+Treg细胞(Treg细胞)的比例。以SPSS 16.0软件进行统计学分析。结果:空白对照组、AR模型组、双侧ADX/AR组、单侧ADX/AR组小鼠OVA-s Ig E的表达量分别为(28.86±3.62)ng/ml、(76.27±16.47)ng/ml、(48.37±8.89)ng/ml、(49.86±7.19)ng/ml,AR模型组显著高于其他3组,差异有统计学意义(t值分别为7.09、4.81、5.21,P值均<0.05)。各组小鼠Th2细胞表达率分别为(0.71±0.24)%、(7.03±1.95)%、(2.44±2.06)%、(3.20±1.21)%,AR模型组显著高于其他3组,差异有统计学意义(t值分别为—2.93、—4.67、—3.61,P值均<0.05);双侧ADX/AR组较单侧ADX/AR组表达率降低,但差异无统计学意义(t=4.39,P>0.05)。各组小鼠Th1细胞表达率分别为(0.58±0.76)%、(0.57±0.59)%、(0.72±0.34)%、(1.03±0.32)%,两两组间比较差异无统计学意义。各组小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞含量分别为(11.10±2.18)%、(4.10±1.07)%、(7.15±0.92)%、(4.58±1.05)%,与空白对照组相比,其他3组该指标均显著降低,差异有统计学意义(t值分别为—7.171,—8.273,—8.360,P值均<0.05);与AR模型组相比,双侧ADX/AR组、单侧ADX/AR组CD4+CD25+Treg细胞比例增多,前者差异有统计学意义(t=—2.607,P<0.05),后者差异无统计学意义(t=—1.592,P>0.05)。与AR模型组相比,双侧ADX/AR组小鼠鼻黏膜嗜酸粒细胞和肥大细胞浸润程度较轻,肥大细胞无明显脱颗粒现象。结论:单侧或双侧ADX导致HPA轴功能缺陷,可引发内源性糖皮质激素紊乱,进一步影响Th1/Th2免疫平衡以及Treg细胞反应,对AR发病有重要调控作用。第二部分:时钟基因Period2调控变应性鼻炎小鼠鼻过敏症状周期反应的机制研究目的:变应性鼻炎(AR)患者的鼻过敏症状呈现“昼夜节律”(circadian rhythm)现象,可能与机体生物钟(circadian clock)活动密切相关。新近研究报道内源性糖皮质激素(GC)能够重设(resetting)小鼠鼻黏膜组织中时钟基因Per2的周期性表达,,但其具体机制尚不清楚。因此,本研究拟通过动物模型探究不同时间节点中AR小鼠鼻过敏症状周期性发作与时钟基因(clock genes)节律性表达的反应关系。方法:根据内源性GC时间性的峰谷分泌特点,选择昼夜两个不同的时间点,ZT4(10A.M.,小鼠睡眠期)和ZT16(10 P.M.,小鼠活动期),对应进行OVA致敏和激发,制备AR小鼠模型,并以PBS替代干预设为对照组小鼠。于造模完成后24h,分别在ZT4和ZT16时观察并记录在10mins内各组小鼠挠鼻子(nasal rubbing)和打喷嚏(nasal sneezing)的次数,比较各组小鼠鼻部症状学评分;分离并获取鼻中隔黏膜组织,采用H&E和甲苯胺蓝进行染色,观察并比较各组小鼠鼻黏膜组织中EOS和MC计数;离心并收集血浆样本,采用ELISA法检测各组小鼠血浆中皮质酮、总Ig E、OVA-s Ig E、IFN-γ、IL-4、IL-13和IL-17A浓度;分离并提纯外周血单核淋巴细胞(PBMCs),采用流式细胞术检测各组小鼠PBMCs中Th1、Th2和Th17的比例;分别萃取鼻黏膜组织和PBMCs中RNA,采用q RT-PCR法检测各组小鼠鼻黏膜组织和PBMCs中时钟基因Per1、Per2、Per3 m RNA以及PBMCs中Th-相关转录因子T-bet,Gata3,E4bp4,Rorgt m RNA的表达情况;分别对AR组小鼠在ZT4和ZT16时鼻部症状学评分与皮质酮浓度变化、PBMCs中时钟基因Per2 m RNA与Th-相关转录因子的表达情况进行相关性分析。结果:(1)与对照组相比,AR组小鼠挠鼻子和打喷嚏的次数在ZT4时显著高于ZT16时,两两比较差异有统计学意义(tnasal rubbing,AR=-3.391,p<0.01;tnasal sneezing,AR=-1.779,p<0.05);其中,AR组小鼠鼻部症状学评分在ZT4时和ZT16时分别为(8.63±0.52)和(6.50±0.53),前者显著高于后者,两两比较差异有统计学意义(tscores,AR=-3.475,p<0.01)。(2)对照组和AR组小鼠血浆中皮质酮浓度呈现明显的昼夜节律性波动,在ZT4时均显著低于ZT16,两两比较差异有统计学意义(tcorticosterone,AR=-3.477,tcorticosterone,control=-3.099,p<0.01);其中,在ZT4和ZT16时,AR组小鼠鼻部症状学与血浆中皮质酮浓度呈现明显的负相关。(3)与对照组相比,AR组小鼠鼻黏膜组织中EOS和MC的数量在ZT4时显著高于ZT16时,两两比较差异有统计学意义(t EOS,AR=1.143,t MC,AR=0.999,p<0.05);同时,AR组小鼠血浆中总Ig E浓度在ZT4时显著高于ZT16时,两两比较差异有统计学意义(t total Ig E,AR=0.734,p<0.05)。(4)与对照组相比,AR组小鼠血浆中IFN-γ和PBMCs中Th1细胞的比例在ZT4时显著低于ZT16时,两两比较差异有统计学意义(t IFN-γ,AR=-7.449,p<0.01;t Th1,AR=-2.306,p<0.05);相反地,AR组小鼠血浆中IL-4、IL-13、IL-17A以及PBMCs中Th2细胞和Th17细胞的比例在ZT4时显著高于ZT16时,两两比较差异有统计学意义(t IL-4,AR=6.446,t IL-13,AR=3.363,t IL-17A,AR=5.630,p<0.01;t Th2,AR=3.201,p<0.01;t Th17,AR=3.756,p<0.01)。(5)与对照组相比,AR组小鼠鼻黏膜和PBMCs中时钟基因Per2m RNA含量在在ZT4时显著低于ZT16时,差异比较有统计学意义(t Per2,AR=-2.970,p<0.01;t Per2,PBMCs,AR=-4.204,p<0.05);AR组小鼠PBMCs中Th2正相关转录因子Gata3 m RNA含量和Th17正相关转录因子Rorgt m RNA含量在在ZT4时显著高于ZT16时,两两比较差异有统计学意义(t Gata3,AR=1.096,t Rorgt,AR=1.437,p<0.05);而AR组小鼠PBMCs中Th2和Th17负相关转录因子E4bp4 m RNA含量在ZT4时显著低于ZT16时,两两比较差异有统计学意义(t E4bp4,AR=0.733,p<0.05)。(6)AR组小鼠在ZT4和ZT16时血浆中皮质酮浓度与PBMCs中Per2 m RNA含量呈现正相关,然而,其鼻部症状学评分与PBMCs中Per2 m RNA含量呈现负相关;另外,AR组小鼠在ZT4和ZT16时PBMCs中Per2 m RNA含量与Gata3 m RNA含量以及Rorgt m RNA含量均呈现负相关性,但与E4bp4 m RNA含量呈现正相关。结论:小鼠鼻黏膜组织和PBMCs中时钟基因Per2的表达具有相似的周期性波动,通过协同作用影响AR过敏症状的昼夜节律变化;时钟基因Per2可能具有抗炎的作用,其潜在机制在于周期性调控Th2和Th17相关转录因子Gata3和Rorgt的免疫反应。本研究初步证实了生物钟参与并调控AR的发生与发展,为探究AR的神经-免疫-内分泌调控机制奠定理论基础,为下一步在临床上实现AR的“时间生物学疗法”提供有效依据。第三部分:生物钟节律紊乱通过减少Occludin和ZO-1合成加重小鼠鼻腔炎症反应的机制探究目的:观察并评估生物钟节律紊乱(circadian rhythm disruption,CRD)对小鼠鼻部过敏症状和焦虑样行为的影响,探究CRD对变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)发病中鼻腔局部和全身系统免疫反应的影响。方法:以正常12:12h光照/黑暗交替周期为参照,通过不规律变换光照周期构建CRD小鼠模型,同时制备OVA诱导的AR小鼠模型。选取8周龄的Balb/c小鼠,采用数字表法随机分为空白对照组(NC组)、正常AR组(AR组)、生物钟节律紊乱对照组(CRD+NC组)和生物钟节律紊乱AR组(CRD+AR组),每组各12只。在造模期间,观察并记录每只小鼠的日常行为表现,采用q RT-PCR检测小鼠鼻黏膜组织中主要时钟基因Clock,Bmal1,Per1,Per2 m RNA的表达情况,用以评估CRD模型。通过比较各组小鼠的鼻症状学评分以及观察各组小鼠在旷场中的运动情况,初步评估CRD对小鼠AR症状和焦虑行为的影响;通过q RT-PCR法检测各组小鼠鼻黏膜组织中紧密连接蛋白Occludin m RNA和ZO-1 m RNA的含量,用于评估鼻黏膜局部炎症反应;通过ELISA法测定各组小鼠血浆中OVA-s Ig E及Th-相关细胞因子的浓度,流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中Th1,Th2,Th17,Treg的比例,进一步研究CRD对小鼠AR发病中系统性免疫反应的影响。结果:(1)CRD可导致小鼠自身的昼伏夜出节律性行为逐渐减弱,q RT-PCR结果显示:CRD+NC组和CRD+AR组小鼠鼻黏膜组织中核心时钟基因Clock,Bmal1,Per1,Per2m RNA的周期性表达出现异常,判定CRD模型成功。(2)与NC组和CRD+NC组相比,AR组和CRD+AR组小鼠鼻部过敏症状明显,说明AR造模成功。AR组和CRD+AR组小鼠的鼻部症状学评分对应为(6.63±1.06)和(8.38±0.74),且两两相比有明显统计学差异(P<0.05);旷场试验观察发现:AR组小鼠在中央区域的平均停留时间显著高于CRD+AR组,两两比较有明显统计学意义(P<0.05);可见CRD能够加重AR小鼠的鼻过敏症状,同时AR小鼠伴随明显的焦虑样反应。(3)与AR组相比,CRD+AR组小鼠鼻黏膜组织中可见大量EOS浸润、MC脱颗粒和杯状细胞增生,ELISA检测发现血浆中OVA-s Ig E含量明显增多,两两比较有显著统计学差异(P<0.05)。(4)CRD+AR组小鼠血浆中Th2型细胞因子(IL-4,IL-6,IL-13,IL-17A)的浓度以及脾脏单个核淋巴细胞中Th2细胞(CD4+IL-4+T细胞)和Th17细胞(CD4+IL-17A+T细胞)的比例显著高于AR组,而CRD+AR组小鼠血浆中Th1型细胞因子(IFN-γ)的浓度以及脾脏单个核淋巴细胞中Th1细胞(CD4+IFN-γ+T细胞)和Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+T细胞)的比例显著低于AR组,两两比较有统计学差异(P<0.05)。结论:在实验条件下“模拟”人类由于外界时差变化导致的CRD,通过影响小鼠局部(鼻黏膜)和全身(脾脏)免疫反应,造成Th2和Th17反应增强,Th1和Treg反应减弱,从而加重AR小鼠的鼻过敏症状和焦虑样行为,表明生物节律在AR发病中具有重要的调控作用。本研究结果提示人们应该尽量保持规律的生活作息,减少现代社会快节奏带来的CRD,从而降低AR等变应性疾病的发生风险。在后续研究中,我们将会深入探讨CRD对免疫反应中信号通路的作用机制,以进一步阐明生物钟与AR发病的内在联系。