草甘膦因为其高效性、广谱性、内吸传导型、低毒等特点,是当今农业生产中使用面积最广、生产销量最大、最具商业价值的的一种除草剂。其作用的机制是通过竞争性的抑制植物莽草酸途径的关键酶5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase,简称EPSP合成酶)的催化作用阻断植物芳香族氨基酸的合成,进而导致植物失绿死亡。此外,由于草甘膦具有非选择性,在杀灭杂草的同时会对田间作物也造成伤害,所以通过分子育种途径培育抗草甘膦作物是杂草防治的重要手段之一。通过将抗草甘膦的EPSPS基因导入作物,可获得具有草甘膦抗性的转基因品种。玉米(Zea mays.L)作为全球产量最大的的粮食作物,同时又是重要的饲料、经济和能源作物,在全世界广泛种植。随着抗性杂草的不断产生,原有的除草剂使用效果欠佳,草害对玉米产量的影响愈发明显,培育抗草甘膦玉米对于提高玉米产量和品质有着重要的现实意义。本实验所用的抗草甘膦基因EPSPS来源于可变盐单胞菌(Halomonas varabilis)(简称H Var-EPSPS)。为了提高转基因玉米的的草甘膦抗性,首先对H.Var-EPSPS基因序列依据玉米密码子偏倚性进行优化,然后利用重叠延伸法对优化后的cDNA序列进行定点突变获得了两个修饰的H.Var-EPSPS基因序列,即EPSPSM1和EPSPSM2。EPSPSM1是将第295位碱基由胸腺嘧啶(T)突变为鸟嘌呤(G),第299位碱基由鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C),使其编码的氨基酸序列发生变化。即第99位丝氨酸(Ser)突变为丙氨酸(Ala),100位甘氨酸(Gly)突变为丙氨酸(Ala)。EPSPSM2是在EPSPSMl的基础上再将第292位碱基由鸟嘌呤(A)突变为胸腺嘧啶(T),即将第98位天冬酰胺(Ash)突变为酪氨酸(Tyr)。通过三维结构预测发现,EPSPSM1和EPSPSM2在与底物结合的位点处构象发生了变化。为了验证突变后的H.Var-EPSPS是否能提高转基因玉米草甘膦抗性,分别将EPSPSM1和EPSPSM2基因插入以玉米ubiquitin启动子启动、水稻GluB5基因的3’UTR为终止子的表达插盒中,并将该插盒重组到以bar基因作为筛选标记的植物表达载体中。其中bar为依据玉米密码子偏倚性进行过优化的基因,由增强型CaMV35S启动子启动,以水稻GluB5基因的3’UTR终止。通过农杆菌介导的玉米无菌幼苗茎尖转化法,将两个带有目的基因的植物表达载体分别转化入玉米骨干自交系昌7-2中,获得了具有双重除草剂抗性的转基因玉米植株。转基因玉米的分子生物学验证首先利用PCR的方法检测转基因玉米的bar基因和EPSPSM1或EPSPSM2基因,确定它们已整合到了玉米基因组。在T1代抗性植株检测中,C72-M1的76株TO植株的自交后代中,有32个株系检测到bar基因和EPSPSM1基因,阳性率为42.1%；在C72-M2的70株T0植株自交后代中,有29个株系检测到bar基因和EPSPSM2基因,阳性率为41.4%。对T1代转基因阳性植株自交结籽,通过逐代的除草剂筛选和PCR检测获得了转基因纯合的T3代植株。然后通过Western Blot的方法检测转基因编码产物EPSPSM1和PSPSM2在T3代转基因植株中组成型表达。转基因玉米的除草剂抗性鉴定在转基因玉米除草剂抗性鉴定中,将本课题中产生的转基因玉米和未优化的H. Var-EPSPS转基因玉米、进行过玉米密码子偏倚性修饰的H.Var-EPSPS转基因玉米同时进行草甘膦处理,以确定基因突变的效果。在玉米植株4叶期时喷施有效成分为2.52 kg ae ha-1草甘膦,即田间标准使用剂量的3倍,观测植株生长状况及成活率。结果表明本实验培育的转基因植株仍能保持良好的生长状态,即突变过的EPSPSM1或EPSPSM2确实提高了转基因植株的草甘膦抗性。同时转基因植株还具有良好的草丁膦抗性,3叶期可耐0.412kg ae ha-1的草丁膦处理。我们获得了兼抗两种不同作用机制除草剂的转基因玉米纯合系。在玉米田间杂草防治中,可以选择性地喷施一种或两种除草剂或喷洒混合除草剂溶液来控制杂草,不仅能高效控制草害,而且可有效推迟抗性杂草的进化。本实验获得的具有双重除草剂抗性的的转基因玉米,为培育我国具有自主知识产权的抗除草剂玉米品种奠定了基础。