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目的:探讨WISP1在肝癌中的表达及生物学功能;FAT10调控WISP1对肝癌细胞生物学特性的影响;明确FAT10调控WISP1蛋白表达的机制;明确FAT10通过稳定β-catenin促进WISP1mRNA的表达;明确FAT10导致WISP1蛋白和mRNA表达不一致的机制。最终明确FAT10调控WISP1表达的分子机制及对肝癌细胞生物学特性的影响。方法:一、蛋白质谱等检测WISP1蛋白在肝癌组织中的表达水平;单因素和多因素回归分析WISP1表达与患者临床病理特征的关系;生存分析分析WISP1表达与患者总体生存率的关系;二、改变肝癌细胞系WISP1的表达,检测细胞增殖能力及增殖相关抗原的表达;肝癌细胞株中改变FAT10表达的同时改变WISP1的表达,检测细胞增殖能力及增殖相关抗原表达的改变;改变FAT10表达的同时改变WISP1表达,检测肝癌细胞增殖能力的变化;在敲除FAT10细胞株中回复FAT10表达或者诱导FAT10的表达,检测WISP1蛋白表达的变化;三、免疫共沉淀(Co-IP)等检测内源性和外源性FAT10和WISP1的结合及共定位;沉默UBA6和USE1表达后,免疫共沉淀检测FAT10-WISP1复合物的改变;构建Flag-FAT10ΔGG突变型的过表达质粒,检测WISP1和FAT10的结合与WISP1蛋白表达水平的变化;分别过表达野生型FAT10和突变型FAT10ΔGG,WB检测WISP1蛋白和mRNA的变化;在肝癌细胞系中过表达FAT10,检测WISP1蛋白和mRNA表达的变化。四、改变β-catenin的表达,检测WISP1蛋白、mRNA及启动子荧光素酶水平的变化;改变FAT10的表达,检测β-catenin蛋白、WISP1蛋白及mRNA的变化;过表达FAT10同时改变β-catenin的表达,检测β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化;五、在逐渐过表达FAT10同时加或者不加β-catenin抑制剂,检测FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化;逐渐过表达FAT10或者FAT10ΔGG,检测FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化;过表达FAT10或者FAT10ΔGG肝癌细胞注射株裸鼠成瘤,WB、荧光定量PCR免疫组织化学、原位杂交实验检测FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化;六、检测新鲜肝癌组织中FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的变化;分析四者相关性;免疫组织化学和原位杂交检测FAT10、β-catenin、WISP1蛋白和mRNA的表达;结果:一、蛋白质谱等结果表明:WISP1蛋白在肝癌肿瘤组织中低表达;进一步分析显示:低WISP1蛋白表达与肿瘤大小、临床分期有显著相关性,低WISP1蛋白表达的患者有着更短的总生存时间;WISP1是肝癌患者预后不良的独立危险因素;二、WB结果表明在肝癌细胞中WISP1蛋白的表达明显低于正常肝细胞;细胞功能实验及WB结果显示:过表达WISP1降低肝癌细胞的细胞增殖能力及细胞周期蛋白D1和增殖细胞核抗原(PCNA)表达;裸鼠成瘤实验表明,过表达WISP1抑制肝癌细胞的成瘤能力,同时瘤体免疫组化证实Cyclin D1和PCNA的表达明显减少;三、WB结果显示在肝癌细胞中FAT10蛋白呈高表达,WISP1蛋白低表达;在肝癌细胞中下调FAT10表达增加WISP1蛋白的表达,而过表达FAT10明显降低WISP1蛋白表达;体内和体外实验结果表明,下调WISP1蛋白表达明显抑制低表达FAT10肝癌细胞中WISP1蛋白表达,回复了FAT10低表达导致的肝癌细胞增殖能力的下降;相反,上调WISP1蛋白表达回复了高表达FAT10肝癌细胞中WISP1蛋白表达,抑制了FAT10高表达导致的肝癌细胞增殖能力的升高;此外,在FAT10敲除细胞系中回复FAT10的表达,WISP1蛋白表达显著减少,诱导FAT10表达,WISP1蛋白表达无明显变化。四、Co-IP和激光共聚焦结果表明FAT10和WISP1存在相互作用;沉默E1和E2酶的表达,WISP1–FAT10复合物均显著降低,而WISP1蛋白表达增加;野生型FAT10可与WISP1结合并降低WISP1蛋白的表达,FAT10ΔGG不能结合WISP1,却导致WISP1蛋白表达增加;在肝癌细胞系中过表达FAT10增强WISP1mRNA表达,同时降低了WISP1蛋白表达;五、下调β-catenin蛋白表达降低WISP1mRNA和蛋白的表达,上调β-catenin蛋白表达导致了相反的结果;进一步的实验表明在肝癌细胞中β-catenin蛋白直接结合到WISP1启动子和调控WISP1表达;过表达FAT10增加β-catenin蛋白表达,β-catenin的mRNA表达无明显变化,而WISP1 mRNA表达增加,下调FAT10表达出现相反的结果;低表达或抑制β-catenin的表达同时过表达FAT10,WISP1表达下调或无变化。相反,低表达FAT10细胞中的过表达β-catenin,WISP1mRNA表达被回复。六、不加β-catenin抑制剂,过表达FAT10导致在WISP1蛋白下降和mRNA增加不一致现象,加入则不出现不一致现象;过表达FAT10△GG,WISP1蛋白和mRNA的表达均逐渐升高,也不出现不一致现象;体内实验进一步证实了这一现象;进一步,检测临床标本中FAT10和WISP1蛋白和mRNA表达的相关性,发现FAT10与WISP1蛋白负相关,与其mRNA正相关;而WISP1蛋白负和mRNA表达负相关。结论:(1)WISP1蛋白在肝癌组织中低表达,过表达WISP1抑制肝癌细胞增殖;(2)FAT10通过FAT10化降解WISP1促进肝癌细胞增殖;(3)FAT10通过稳定β-catenin促进WISP1mRNA的表达;(4)FAT10同时发挥降解和稳定功能导致WISP1蛋白和mRNA表达不一致。