血管性认知障碍（vascular cognitive impairment,VCI）是指由脑血管病危险因素、显性脑血管病及非显性脑血管病引起的从轻度认知损害到痴呆的综合征,包括非痴呆性认知功能障碍和血管性痴呆（Vascular dementia,VD）。随着社会人口老龄化进程的加剧,VCI的发病率、患病率、致残率和死亡率日益升高。VCI发展为VD的比例逐年升高,在欧美地区,继阿尔茨海默病（Alzheimer’Disease,AD）后,VD已成为第二大痴呆类型,而在亚洲地区,已成为痴呆患者中第一大病因。VD以慢性进展性认知损害为主要表现,其认知损害的程度已严重影响了患者的日常生活能力、职业和社交能力,给家庭和社会带来了沉重的经济和社会负担。血管性因素的可控性使VD变得可防可治,因此,针对VCI早期给予治疗,阻止VCI向VD发展,是我们亟待解决的问题。关于VCI的发病机制,血管性因素为始动因素,在VCI向VD进展过程中,目前认为许多机制参与其中,比如慢性脑低灌注、缺血再灌注损伤、氧化应激、炎症反应等。有实验证实,内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）在VD发展过程中起重要作用。内质网是细胞内一种重要的细胞器,它参与了蛋白质正确折叠与分泌。当体内异常蛋白聚集超过内质网的转录功能时就会产生内质网应激。ERS可在缺糖缺氧、钙失调、氧化应激及毒素等因素影响下诱发。早期的急性期的内质网应激是在应激状态下,机体的适应性反应,对疾病的病理过程起到有益的作用。但是,持续的内质网应激则会超过机体的识别能力,引发细胞凋亡,从而导致疾病的发展。ERS主要有三条通路,最重要的是未折叠/错误折叠蛋白质过量聚集引起的未折叠蛋白质反应（unfolded protein response,UPR）。UPR有三条重要通路:1)双链RNA依赖的蛋白激酶样ER激酶（Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK）通路;2)跨膜蛋白激酶1（inositol-requiring enzyme 1a,IRE-1ɑ,又称核酸内切酶）通路;3)激活作用转录因子6（activating transcription factor 6,ATF6）通路;UPR在VD的发展过程中起重要作用。ERS可以通过抑制海马神经元凋亡,改善VD大鼠的学习和记忆能力,但是其发挥作用的具体机制不详。Sonic hedgehog（Shh）是分泌性糖蛋白因子,在神经发育过程中起着重要作用。它与Patched1（Ptch1）结合,激活下游的Smoothened co-receptor（Smo）和Gli transcription factor1（Gli1）,从而调节神经元在内的各种细胞的生长和分化。该通路可以促进神经元的生长、促进血管新生以及促进突触的形成和突触的可塑性。在VD的发展过程中,很多信号传导通路参与其中。Shh/Ptch1通路的激活在VD的发展过程中,能否改善VD的认知水平未见报道。研究表明,Shh/Ptch1通路和ERS密切相关。缺乏Shh可以引发ERS,而ERS可以促进Shh/Ptch1通路的表达,进而促进细胞的生长。但是二者具体的关系未见明确报道。丁苯酞（DL-3-n-butylphthalide,NBP）是芹菜籽的提取物,它不仅能改善脑缺血,还能通过保护海马的神经元,减少凋亡,促进脑血流等,从而改善血管性认知障碍患者的认知水平。丁苯酞改善VD大鼠的学习记忆功能,对VD大鼠的保护作用,是否与调节ERS有关;是否与激活Shh/Ptch1通路有关,未见报道。基于上述研究背景,我们采用结扎双侧颈总动脉（bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO）的方法,建立VD大鼠模型,术后给予NBP进行干预,观察:1)NBP可以改善VD大鼠的学习记忆功能,具有保护作用;2)NBP的保护作用是否与调节ERS相关蛋白的表达有关;3)Shh/Ptch1通路是否参与了VD的发展;4)NBP的保护作用是否和激活Shh/Ptch1通路有关;5)内质网应激相关蛋白和Shh/Ptch1通路在VD发展过程中可能的相互作用。第一部分不同剂量丁苯酞对血管性痴呆大鼠认知功能的影响目的:通过BCCAO的方法建立VD大鼠模型,术后给予VD大鼠30mg/kg、60mg/kg和120 mg/kg丁苯酞灌胃,术后4周利用Morris water maze（MWM）水迷宫进行行为学测试,hematoxylin and eosin（HE）染色观察海马神经元形态学异常,从而探讨NBP对VD大鼠认知功能的改善作用。方法:3月龄250-300g雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只,随机分为5组:假手术组（Sham组）,模型组（Model组）,NBP低剂量治疗组(NBP₃₀组)、中等剂量组(NBP₆₀组)和NBP高剂量治疗组(NBP₁₂₀组)。术后24h治疗组经灌胃按30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg给予NBP,Sham组和Model组给予等剂量玉米油进行灌胃,给药28天后,对所有存活下来的大鼠进行为期6天的Morris水迷宫实验,测试大鼠空间学习能力和记忆能力:1)定位航行实验（Place navigation test）:连续训练5天,每天训练4次,记录大鼠的逃避潜伏期（escape latency）,即从入水到寻台成功的时间,反映大鼠的空间学习能力。2)空间探索实验（Spatial probe test）:在定位航行实验结束的第二天,撤除平台,记录大鼠120s内在原平台象限的停留时间占总时间的百分比（目标象限停留时间百分比）,反映大鼠空间记忆能力。行为学测试结束后,HE染色观察大鼠海马神经元形态学变化。结果:Morris水迷宫实验时,在定位航行实验阶段,随着训练天数的增加,五组大鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短。且从训练第2天开始,Model组大鼠逃避潜伏期较Sham组大鼠明显延长,3-5天时逃避潜伏期延长更加显著,具有统计学差异（P<0.05）;从第2天开始,NBP₃₀、NBP₆₀和NBP₁₂₀组大鼠表现出逃避潜伏期较Model组大鼠明显缩短（P<0.05）,第4、5天时各治疗组较Model组大鼠逃避潜伏期缩短更加明显（P<0.05）,尤其以NBP₁₂₀组缩短更加显著。同时经比较发现,随着NBP剂量的增加大鼠逃避潜伏期逐渐缩短,但各治疗组间均无统计学差异。然而,虽然各治疗组间无统计学差异,但是在第5天时,NBP₁₂₀组大鼠的逃避潜伏期与Sham组无统计学差异;在空间探索实验阶段,与Sham组相比,Model组大鼠在目标象限停留时间百分比明显降低（P<0.05）;与Model组相比,各治疗组大鼠在目标象限停留时间百分比均明显增加（P<0.05）,但各组之间没有差异。行为学测试完毕后,进行HE染色,Sham组大鼠海马CA1区锥体神经元排列紧密、均匀,细胞排列有序,层次清楚,细胞形态正常,大小正常,结构完整,胞核大而圆,核仁清晰可见;而Model组大鼠CA1区锥体神经元缺失明显,排列疏松,锥体神经元形态不规则,神经元胞体呈梭形或多角形,可见胞核固缩。给予30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg的NBP后,SD大鼠海马CA1区锥体神经元丢失明显减少,细胞形态较饱满,细胞排列较为紧密均匀,层次较清晰,可见少量核固缩,以NBP₁₂₀组改善最明显。小结:BCCAO法制备的VD大鼠模型,术后4周在Morris水迷宫测试中表现出明显的空间学习能力和记忆功能受损,伴有海马CA1区神经元形态异常、数量减少,给予30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg的NBP后能明显改善行为学和形态学的异常,增加存活神经元数量,以NBP₁₂₀组给药效果最好。第二部分不同剂量丁苯酞对血管性痴呆大鼠海马突触可塑性相关蛋白的影响目的:制备VD大鼠模型后,4周时取材观察各组大鼠海马突触蛋白SYN、GAP43和PSD95的变化,并检测给予30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg的NBP后能否通过上调SYN、GAP43和PSD95突触蛋白表达发挥神经保护作用。方法:按照第一部分进行分组和模型制备。实时荧光定量PCR（Real Time-PCR,RT-PCR）法和Western blot法检测各组间SYN、GAP43和PSD95基因和蛋白的表达情况。结果:与Sham组相比,Model组中突触可塑性相关蛋白在基因和蛋白两个水平上的表达均有下降（P<0.01）;给予30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg的NBP后,各治疗组与Model组相比,SYN、GAP43和PSD95在基因和蛋白水平上均上调,尤其以NBP₆₀组和NBP₁₂₀组显著（P<0.01）。在蛋白水平上,NBP₁₂₀组对SYN和PSD95蛋白表达的影响存在显著差异;同时各治疗组间PSD95的表达存在显著差异（P<0.01）;而NBP₁₂₀组和Sham组无差异。在基因水平上,NBP₁₂₀组对SYN和GAP43的影响较NBP₃₀组和NBP₆₀组显著（P<0.05）。然而,各治疗组间并不存在剂量依赖关系。小结:给予30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg的NBP后,可以从蛋白和基因水平上上调突触可塑性相关蛋白SYN、GAP43和PSD95的表达,从而改善VD大鼠的认知功能。第三部分不同剂量丁苯酞对血管性痴呆大鼠内质网应激相关蛋白的影响目的:制备动物模型后,观察各组海马组织中内质网相关蛋白PERK,elF2α,IRE1,XBP1,XBP1s,ATF6,GRP78,CHOP和caspase-12的表达变化,探讨内质网应激在VD形成过程中的作用,并观察不同剂量NBP对海马组织中PERK,elF2α,IRE1,XBP1,XBP1s,ATF6,GRP78,CHOP和caspase-12表达的影响,探讨NBP是否能通过调节内质网应激的水平,从而减轻急性期的内质网应激而发挥脑保护作用。方法:按照第一部分进行分组和模型制备。取材后应用RT-PCR法和Western blot法检测各组间PERK,elF2α,IRE1,XBP1,XBP1s,ATF6,GRP78,CHOP和caspase-12的表达变化情况。结果:1.Western blot方法检测发现各指标的变化:与Sham组相比,Model组中内质网应激各指标均显著上调（P<0.05）;除了NBP₃₀组中GRP78的表达与Model组相比没有统计学意义外（P>0.05）,其他各治疗组中其余的指标均有所下调（P<0.05）;各治疗组对XPB1的表达没有统计学意义（P>0.05）;除了XPB1和elF2α两个蛋白外,NBP₁₂₀组对内质网应激的各指标均有显著下调作用（P<0.05）;各治疗组间内没有剂量依赖关系。2.RT-PCR法检测各指标的变化:与Model组相比,除了CHOP和elF2α的mRNA水平外,NBP₁₂₀组对内质网应激的其余各指标均有显著下调作用（P<0.01）;有趣的是,与Model组相比,CHOP和elF2α两个指标的mRNA水平在NBP₃₀组显著升高（P<0.01）;而且这两个指标的mRNA水平在NBP₆₀组和Model组之间差异没有统计学意义。小结:VD大鼠模型术后4周,海马组织细胞内内质网应激活跃,各指标表达上调,对细胞产生促进凋亡作用。此部分实验证实了内质网应激参与了VD的发生发展过程。给予30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg的NBP后,通过调节内质网应激各指标PERK,elF2α,IRE1,XBP1,XBP1s,ATF6,GRP78,CHOP和caspase-12的表达,从而抑制细胞凋亡,促进细胞生存,发挥神经保护作用,尤其是NBP₁₂₀组对所有指标的表达均有下调作用。该部分实验说明NBP对VD大鼠认知功能的改善作用可能是通过调节内质网应激来实现的。第四部分不同剂量丁苯酞对血管性痴呆大鼠Shh/Ptch1信号通路的影响目的:观察VD大鼠海马组织Shh、Ptch1、Smo和Gli1信号通路的变化,探讨Shh/Ptch1信号通路在VD发生发展中的作用,并观察不同剂量NBP对海马组织中Shh、Ptch1、Smo和Gli1表达的影响,探讨NBP对神经功能的保护作用是否通过调节Shh/Ptch1信号通路而实现。方法:按照第一部分进行分组和模型制备。实时荧光定RT-PCR法和Western blot法检测术后给予给予30mg/kg、60mg/kg和120mg/kg的NBP后Shh、Ptch1、Smo和Gli1基因或蛋白的表达情况。结果:无论是Western blot方法检测还是RT-PCR检测均发现:与Model组相比,Model组中Shh、Ptch1、Smo和Gli1各指标的表达均显著下调（P<0.01）;Western blot方法检测发现,所有的治疗组与Model相比,Shh、Ptch1、Smo和Gli1各蛋白的表达均显著上调（P<0.01）;尤其是NBP₁₂₀组对各蛋白的上调作用更加显著（P<0.05）。RT-PCR结果发现,NBP₆₀组和NBP₁₂₀组对Shh和Gli1指标的mRNA水平的表达作用没有统计学差异;而对Ptch1和Smo的mRNA的表达各治疗组间内有统计学差异（P>0.05）。各治疗组间并不存在剂量依赖关系。小结:VD大鼠海马组织细胞内Shh/Ptch1通路各指标表达下调,表明该通通参与VD的发展过程;给予NBP后该通路被不同程度的激活,促进海马神经元的存活,促进突触的形成并调节其可塑性,进而改善认知功能,起到神经保护的作用。Shh/Ptch1通路的神经保护作用可能独自起作用,以可能与ERS共同作用,具体机制需进一步研究。