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蜘蛛毒素蛋白由于其序列短而且富含二硫键,所以采用基因工程的方法表达困难.在该文的研究中,我们从原核直接表达,原核融合表达,原核分泌表达,真核分泌表达四种途径尝试了蜘蛛毒素的表达,找到了几种实现蜘蛛毒素表达的新途径.其中HWTX-Ⅰ采用原核融合载体pET<,31>b表达成功,其产率为每升20-30μg;HWTX-Ⅺ采用原核分泌表达载体pMAL-p2X表达成功,产率为每升0.8mg;HWTX-Ⅺ还采用酵母分泌表达载体pVT102U表达成功,产率为12.5mg/L.这些载体的表达的成功不但为相关蜘蛛毒素的研究奠定了良好的基础,而且还说明采用分泌表达的办法对于象蜘蛛毒素这样富含二硫键的多肽分子是比较理想的基因工程表达方式.虎纹毒素Ⅺ(HWTX-Ⅺ)是从蜘蛛毒素中新发现一种毒素,它由55个氨基酸残基组成,含3对二硫键,在蛋白质序列上和Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂及钾通道抑制剂同源.在该文的工作中,我们采用RACE的方法获得的HWTX-Ⅺ的cDNA序列,并使用载体pVT102U实现了在酿酒酵母中的表达.利用此表达体系,我们设计并表达了pVT102U的突变体以进行结构与功能研究.突变体经纯化后采用传统的分光光度计的方法和表面等离子共振的方法对活性进行了研究,发现HWTX-Ⅺ与胰蛋白酶作用的关键活性残基是14位的赖氨酸,此关键残基周围几个残基对胰蛋白酶抑制活性的贡献也通过上面的两种方法进行了比较.结合上面的蛋白序列相似性比较结果和活性研究结果,表明HWTX-Ⅺ是一种Kunitz型的丝氨酸蛋白酶抑制剂,这也是在蜘蛛中发现的第一种丝氨酸蛋白酶抑制剂.我们还从分布于海南省的敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)的粗毒中分离出一种新的毒素,我们把它命名为敬钊毒素Ⅵ(JZTX-Ⅵ).经过N端测序,得到了JZTX-Ⅵ的蛋白质序列"ECTKFLGGCCSEDSECCPHLGCKDVLYYCAW DGTF",通过序列计算的分子量与质谱鉴定的结果吻合.通过碘乙酰胺修饰并结合质谱实验证明了毒素分子中的六个半胱氨酸形成三对二硫键.JZTX-Ⅵ的cDNA序列通过RACE的方法获得,cDNA结构和虎纹捕鸟蛛毒素的cDNA结构很相似.另外,cDNA序列前体的C末端存在着成熟蛋白酰胺化的信号,表明毒素JZTX-Ⅵ的羧基端存在着酰胺化的修饰,这通过质谱的实验得到证实.我们采用全细胞膜片钳的技术研究了JZTX-Ⅵ的生理活性.表明JZTX-Ⅵ作用于DRG细胞上TTX敏感型的钠通道,它能明显延迟TTX敏感型钠通道的失活,电流失活程度呈浓度依赖性地增加;同时抑制峰电流,其抑制程度也呈浓度依赖性增加.JZTX-Ⅵ对DRG细胞上的TTX不敏感型钠通道没有作用.JZTX-Ⅵ对钠通道的作用与α-蝎毒素以及蜘蛛毒素δ-atrocotoxin-Hvla很相似.通过序列比较,我们认为残基Lys4和Asp11在JZTX-Ⅵ与钠通道的相互作用中起到重要作用.