产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是优良的甘油生产菌株,并且已成功的应用于工业生产中。研究者在产甘油假丝酵母菌株的生理生化、发酵工艺优化、代谢机理方面开展了卓有成效的研究。但是与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等模式菌株相比,该工业菌株的遗传和分子生物学信息比较匮乏。在C. glycerinogenes中,甘油合成途径的关键酶—胞浆3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因以及该基因在细胞中的具体的生理功能是未知的。为此,本文从产甘油假丝酵母基因组中克隆出甘油合成的关键酶基因,并对其进行了详细的功能鉴定,最后通过在C. glycerinogenes过表达和缺失研究进一步确定该基因在细胞过量合成甘油中的作用。本文主要研究成果概括如下:(1)利用PCR方法,克隆了C. glycerinogenes的胞浆NAD~+依赖的3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD)。1167 nt的开放阅读框编码一个分子量为43 kDa,包含388个氨基酸的蛋白,氨基酸水平上该基因与具有安格斯毕赤酵母相似性最高,为70.9%,与粟酒裂殖酵母相对较低,仅为46.7%。并且发现在产甘油假丝酵母基因组中仅有一个CgGPD基因,不存第二个同功异构酶编码基因。(2) CgGPD基因在gpd1/gpd2和gpd1酿酒酵母突变株中表达能够显著提高细胞耐渗透压能力和甘油合成能力,表明CgGPD基因能够完全功能互补酿酒酵母GPD1基因的缺失。渗透压诱导实验表明CgGPD基因的表达受到渗透压的生理调控。在野生型酿酒酵母中过量表达CgGPD基因能够大幅度提高细胞的甘油合成能力,同时结果表明CgGPD基因自身上游调控序列能够有效调控基因表达。(3) CgGPD和GPD2基因能够提高hog1细胞的耐渗性,而GPD1基因的表达对突变株的耐高渗透压能力并没有显著提高;在pbs2突变株中分别过量表达CgGPD、GPD1和GPD2基因都能够提高转化子在高渗压条件下的生长性能;过量表达CgGPD和GPD1能够使gpd1/gpd2突变株降低对渗透压的敏感性,GPD2基因的表达则不具这种显著的这种功能;在hog1和pbs2突变株中分别过量表达CgGPD、GPD1和GPD2基因均能使转化子细胞在渗透压刺激下诱导胞内甘油合成和积累;GPD1基因的过量表达仅能一定程度上互补gpd1/gpd2突变株细胞在厌氧环境中GPD2基因的功能,而过量表达CgGPD基因则能够完全功能互补GPD2基因的缺失。(4)根据同源重组原理,以含有腐草霉素(Zeocin)抗性基因的pGAPZb质粒为基本构架,以CgURA3基因作为整合位点构建了用于转化产甘油假丝的酵母的整合载体;分别优化了物理参数和细胞生理参数对电转化效率的影响。结果表明,对数生长中期的细胞经DTT或LiAc预处理后在2×10~9个/mL的细胞浓度下加入200μg的线性整合载体,在1600V电压下,200Ω电阻、25μF电容进行电击,获得的转化效率可达到394个转化子/μg DNA。(5)以腐草霉素抗性基因作为选择标记,分别构建CgGPD基因敲除载体pUC-gpd-Zeoin和同源表达载体pGA-rDNA-CgGPD,导入产甘油假丝酵母细胞,获得稳定的缺失突变株和过表达转化子。甘油发酵实验表明CgGPD基因缺失显著降低了细胞的甘油合成能力,同时增加了细胞的产乙醇能力,而细胞的EMP代谢途径活力的降低导致细胞量显著下降,使得细胞在高浓度葡萄糖下的生长能力受损;过量表达CgGPD基因能够加速葡萄糖的消耗,缩短发酵周期,从而提高甘油的产率和得率,同时胞内副产物丙酮酸、乙酸和乳酸等有一定的提高,而乙醇的生成则受到抑制。