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背景:转录调节因子p53作为一种抑癌基因,在抑制癌细胞生长过程中起到重要的作用。当外来刺激引起DNA损伤或胞内生长信号异常,p53可诱导细胞生长阻滞、细胞凋亡、细胞分化及DNA修复。近来有研究发现p53也参与调控细胞的迁移侵袭。Rap属于小GTP酶蛋白超家族,在信号转导过程中行使分子开关功能,可作用于多种受体蛋白下游,参与细胞的增殖、分化和细胞运动的调节,也影响着许多人类肿瘤的转移。目的:探讨Rap2a和p53的相互作用关系以及Rap2a对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移侵袭的影响。方法:选用U20S和H1299两种癌细胞,加入5 nM放线菌素D(actinomycin D,ActD)24 h后,行RT-PCR检测细胞Rap2a mRNA水平变化;观察加入不同剂量ActD(0,1,5,10nM)后Rap2a、P53和p21蛋白表达水平的变化;观察加入 5nMActD 0h,4h,8h,12h,16h,20h,24h 后 Rap2a、P53 和 p21 蛋白水平的时间依赖性变化;运用体外化学合成p53基因序列特异性小干扰siRNA转染细胞,WesternBlot检测Rap2a和P53蛋白表达的改变;同时,用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChlP)技术观察 Rap2a 与 p53 之间的相互作用关系。观察Rap2a在肿瘤细胞中的蛋白表达情况。运用CCK-8和Annexin V-FITC/PI法检测Rap2a对细胞增殖和早、晚期凋亡的影响,同时用Western Blot检测Bcl-2、Bax和pro-caspase3等增殖凋亡相关蛋白的表达水平。划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测Rap2a对细胞迁移和侵袭能力的影响;明胶酶谱实验检测Rap2a对细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)的影响,并通过Western Blot检测FAK、β-catenin、Akt、p-Akt等蛋白水平变化进一步探讨Rap2a促迁移侵袭的机制。结果:RT-PCR结果显示,ActD作用于U20S细胞24 h后,Rap2a的mRNA水平显著升高,而H1299细胞Rap2a的mRNA水平变化不明显。不同剂量ActD(0,1,5,10nM)作用于肿瘤细胞后,Rap2a、P53和p21蛋白水平呈剂量依赖性增加。5nMActD作用于肿瘤细胞Oh,4h,8h,12h,16h,20h,24h后,Rap2a、P53和p21蛋白水平也逐渐增加,并且在24 h时Rap2a蛋白水平达到最高,且Rap2a蛋白表达的变化与之前的mRNA水平变化基本一致。运用p53 siRNA沉默p53的表达后,Rap2a的蛋白水平随之降低。ChIP实验进一步证实p53在转录水平直接调控Rap2a的表达。Rap2a在肺癌、前列腺癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞中高表达。划痕、迁移和侵袭实验结果显示,Rap2a过表达使U20S细胞的迁移侵袭能力增强,肿瘤细胞分泌MMP2和MMP9的量随之增加。相反的,siRNA沉默Rap2a后细胞的迁移侵袭能力下降,而且其分泌MMP2和MMP9的表达量随之下降。CCK-8增殖实验结果显示Rap2a过表达或沉默后不影响肿瘤细胞的增殖,而Annexin V-FITC/PI实验结果显示Rap2a过表达或沉默后对细胞的早期凋亡和晚期凋亡亦无明显影响。Western Blot检测结果显示转染Rap2a后FAK、β-catenin蛋白表达无明显变化趋势,p-Akt变化趋势明显。结论:Rap2a为p53的靶基因,p53可通过结合Rap2a基因进而调控Rap2a的转录。Rap2a在多种肿瘤细胞中蛋白表达水平升高。Rap2a过表达或沉默后对癌细胞的增殖凋亡无明显影响,但能促进癌细胞的迁移侵袭能力,这种促迁移侵袭的能力可能与Rap2a影响Akt磷酸化水平有关。