电化学发光适配体传感器的构建及其在疾病标志物检测中的应用

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电化学发光是一种由电化学反应驱动的化学发光,它由传统电化学和化学发光技术组成,具有动态范围宽、灵敏度高、背景信号干扰小和高时间、空间分辨率等优点。ECL现已成为一种强大的分析技术,并广泛应用于从基础研究到实际应用的各个方面,如生物传感与成像、环境及食品安全监测和临床检测等领域。为了实现ECL信号放大从而进一步提高其分析的灵敏度,实现痕量目标物的检测,通常的策略是引入一些核酸扩增和循环技术。其主要分为酶辅助的循环扩增方法(如聚合酶链式反应)和无酶循环放大(如链置换),这些技术已广泛应用于传感器的构建。疾病标志物大多情况下为生物体内一些蛋白质的过表达,其可用作疾病的早期筛查,也可作为疾病诊疗过程中的监测指标,但其在生物体中的存在水平极低。因此,开发快速、高灵敏、高精确度检测疾病标志物的方法对临床等领域具有十分重要的意义。本文的研究内容包括三个部分:(1)β-环糊精/g-氮化碳纳米复合材料电化学发光传感器用于PDGF-BB检测利用非共价修饰制备了的β-环糊精/石墨相氮化碳(β-CD/g-C3N4)复合材料,并用于构建电化学发光适配体传感器,实现对血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)的超灵敏检测。β-CD/g-C3N4通过壳聚糖的成膜作用固定在电极上,再通过主客体识别和碱基互补配对,金刚烷标记的DNA和二茂铁标记的适配体会逐步修饰到电极表面。二茂铁分子通过能量传递和电子传递过程可实现对g-C3N4电化学发光信号的的猝灭。由于适配体和目标物之间存在比DNA双链结构之间氢键更强的亲和力,因此当目标物存在时,二茂铁标记的适配体与目标物结合离开电极表面,信号会有一定程度的恢复。ECL信号强度在目标物培养前后的差值与PDGF-BB浓度的对数在0.5 pg/m L–0.5μg/m L呈线性正相关,检测限为0.26 pg/m L。研究结果表明,该方法简单便捷且灵敏度高,可用于实际样品中PDGF-BB的检测。(2)共振能量转移型电化学发光传感器用于凝血酶检测采用简单的水相溶液中纳米共沉淀的方法,合成了PFBT聚合物点新型电化学发光材料,基于PFBT和黑洞猝灭剂(BHQ)分子之间共振能量转移策略,利用链霉亲和素-生物素的快速特异性结合,构建了用于凝血酶(Tb)的灵敏检测的电化学发光适配体传感器。此外,在该电化学发光传感器中通过核酸外切酶Ⅲ辅助的酶促循环可以提高PFBT聚合物点和猝灭剂BHQ分子之间的共振能量转移效率,实现电化学发光信号更大程度上的猝灭,有效的提高了灵敏度。实验结果表明:该传感器在目标物Tb含量为10 pg/m L-100 ng/m L之间时具有良好的响应,检测限为3.9 pg/m L。该方法具有灵敏度高、抗干扰能力强和稳定性好等优点,可应用于实际样品人血清中Tb的检测,具有潜在的应用价值。(3)双重信号放大策略电化学发光传感器用于黏蛋白1检测利用酶辅助循环和链置换的双重信号放大策略构建ECL传感器,实现对目标物黏蛋白1(MUC1)的灵敏检测。以鲁米诺直接还原的纳米金(Au-Luminol NPs)作为信号分子,在共反应剂过氧化氢的存在下,可产生明显的电化学发光响应。通过事先在溶液相中Nt.Bsm AI限制性内切酶辅助的适配体-目标物复合物的循环,可产生大量的中间体DNA(i-DNA)。i-DNA可打开电极表面捕获DNA的发夹结构,信号分子标记的探针通过链置换过程修饰到电极表面同时实现i-DNA的循环利用,构建电化学发光传感器并有效提高灵敏度。实验结果表明,ECL信号强度与目标物MUC1浓度的对数在1 pg/m L-5 ng/m L呈线性正相关,检测限为0.71 pg/m L。该方法灵敏度高,选择性好,可应用于实际样品人血清中MUC1的检测,回收率为95%–104%。
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