背景结肠癌(Colon Cancer)是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,全球结肠癌的发病率已上升至恶性肿瘤的第三位,死亡率居第四位。在我国,结肠癌发病率逐年上升,居消化道恶性肿瘤第三位,且低龄化趋势加剧。外科治疗是结肠癌的主要治疗方式,在可切除的结直肠癌患者中,大约50%患者将会复发,而这些复发患者中的绝大部分将失去治愈机会。全身辅助化疗有助于消灭患者体内的微小转移病变,降低复发风险,增加治愈机会,特别是对于中晚期结肠癌患者,新辅助化疗技术的运用,在术前使肿块缩小、及早杀灭看不见的转移细胞,使患者获得手术治愈的机会。对于失去根治肿瘤机会的晚期结肠癌患者,全身辅助化疗是改善患者预后的重要手段。因此,发现新的结肠癌治疗靶点,阐明其在结肠癌进展中的分子机制,对结肠癌治疗具有非常重要的临床意义。肿瘤微环境(tumor microenvironment)是指肿瘤发生过程中,由肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的结构组分(如胶原蛋白、弹性蛋白、纤维粘连蛋白等)构成的局部稳态环境,肿瘤微环境参与肿瘤细胞凋亡失常、侵袭转移、复发和化疗耐药等恶性进展过程,也是肿瘤细胞代谢重编程的稳态基础。纤维粘连蛋白是构成肿瘤微环境的重要成分,既往研究发现构成细胞外基质的纤维粘连蛋白选择性剪切异构体EDA片段在多种肿瘤中表达上调,其在结肠癌中特异性表达上调,参与结肠癌肿瘤血管、淋巴管生成,上皮间质转化等过程,还能够抑制肿瘤细胞凋亡,表明EDA+FN具有作为结肠癌治疗靶点的分子基础,但EDA+FN调控结肠癌细胞凋亡的分子机制还需要进一步阐明,研究EDA+FN的功能机制有望为临床应用提供理论基础。目的1.探索EDA+FN表达与肿瘤进展信号通路相关性;2.证实EDA+FN调控结肠癌细胞凋亡的作用;3.探讨EDA+FN调控结肠癌细胞凋亡的分子机制。材料与方法1.检索GEO数据库结肠癌基因芯片原始数据,采用Bioconductor、GSEA等生物信息学软件分析EDA+FN高表达与EDA+FN低表达组结肠癌组间信号通路差异,Kaplan-meier分析EDA+FN表达与结肠癌患者临床预后关系;2.干扰结肠癌SW480细胞EDA+FN表达,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测两组间P53、BAX、P21的RNA水平,Western blotting检测组间P53、BAX、Cleaved Caspase3、P21蛋白表达,P53蛋白Ser15、Ser37、Ser392磷酸化水平;免疫荧光技术检测P53亚细胞分布3.EDA+FN过表达慢病毒转染EDA+FN敲低和对照结肠癌SW480细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测P53、BAX蛋白表达和P53磷酸化修饰;蛋白质免疫共沉淀检测P53与EDA+FN相互作用。结果1.基因芯片数据分析表明,EDA+FN低表达组凋亡相关基因和氧化磷酸化相关基因富集上调,EDA+FN高表达组血管生成相关基因、EMT通路基因、糖酵解通路基因富集上调,EDA+FN表达与结肠癌的分期、复发相关,EDA+FN高表达是结肠癌预后不良的风险因素;2.凋亡检测和Western-blotting检测结果表明,干扰EDA+FN表达后,结肠癌SW480细胞凋亡增加,P53-BAX信号通路激活;.免疫荧光和Western-blotting检测结果表明,干扰EDA+FN表达后,结肠癌SW480细胞P53蛋白Ser15、Ser37、Ser392磷酸化水平上调,核内转位增加;3、免疫荧光和Western-blotting检测结果表明,EDA+FN敲低组细胞转染EDA+FN过表达慢病毒后,凋亡率降低,P53蛋白Ser15、Ser37磷酸化水平下调,核内转位减少;蛋白质免疫共沉淀检测发现P53与EDA+FN具有相互作用。主要结论1.干扰EDA+FN表达促进结肠癌细胞凋亡;2.抑制P53-BAX凋亡信号通路激活是EDA+FN调控结肠癌细胞凋亡的主要方式;3.EDA+FN抑制P53磷酸化和核转位调控结肠癌细胞凋亡。