论文部分内容阅读
马铃薯是一种粮、菜、饲及工业原料等多种用途的重要经济作物。内蒙古是中国马铃薯的种薯和商品薯主要产地之一,然而由于干旱缺水使得马铃薯生产发展受到严重限制。为培育出抗旱性强的马铃薯新品种和加速现有主栽品种的遗传改良,本试验采用抗旱性弱的且在我国北方地区大面积种植的马铃薯品种‘费乌瑞它(Favorita)’为受体材料,利用PCR和DNA重组技术从Columbia生态型(Col-0)的野生拟南芥中克隆抗旱性强的CDPK1基因,并采用农杆菌介导方法将其转化到马铃薯品种‘Favorita’中。在PEG模拟干旱胁迫下,通过表型观察、生理指标测定及qRT-PCR检测,对转基因马铃薯植株的抗旱性进行了鉴定。主要结果如下:1.确定了马铃薯微型薯形成的最适诱导培养基和培养条件,建立了马铃薯微型薯薯片的组培再生体系。2.利用启动子分析软件TSSP-TCM和Plantcare分析预测了Rd29A基因ATG上游1524bp的启动子区域,预测出该基因的转录起始位点为A,启动子的基本转录元件为TATA-box和CAAT-box,逆境响应元件为ABA、ABRE和DRE。3.克隆了拟南芥CDPK1全长共2269bp,其中包含了6个内含子和7个外显子;克隆了拟南芥Rd29A基因ATG上游共1524bp的启动子区域,其DNA序列与已知的拟南芥Rd29A基因5′端启动子序列同源性为100%。4.构建了组成型Ca MV 35S启动子和逆境诱导型Rd29A启动子驱动CDPK1基因的植物表达载体,并导入马铃薯品种‘费乌瑞它’中,共获得了93株抗性再生植株。对这些抗性再生植株进行PCR和Southern杂交证明,CDPK1基因以单拷贝形式插入到马铃薯植株的基因组中,且每个株系的插入位点均不同。5.RT-PCR证实在正常生长条件下,组成型转基因马铃薯中检测到CDPK1基因的大量表达,而在诱导型转基因马铃薯植株中检测到微弱的CDPK1表达量;但在干旱胁迫后,诱导型转基因马铃薯植株中CDPK1的表达量显著提高。6.正常生长条件下,组成型转基因植株平均株高和平均单株块茎重量均明显低于对照,分别下降了30%和19%。30%PEG胁迫后,诱导型转基因植株的平均株高明显高于组成型和对照植株,而枯叶率显著低于组成型和对照植株,诱导型植株生长正常,叶片未出现边缘枯死,而此时对照植株的叶边缘枯死。7.20%PEG胁迫下,两种转基因植株中Pro含量始终高于同期非转基因对照植株,组成型和诱导型转基因植株叶片中Pro含量分别比对照提高了26%和34%,均达到了显著差异(P<0.05);转基因植株叶片中MDA含量始终低于同期非转基因对照植株,在处理24h时二者的差异达到最大(P<0.05),其中诱导型和组成型转基因植株叶片中MDA含量分别比对照降低了31%和28%。8.qRT-PCR证实PEG胁迫后,P5CS和ProDH基因的相对表达量都是先升后降;在胁迫处理的中期,转基因马铃薯植株中P5CS和ProDH基因的相对表达量都显著高于对照(P<0.05),而在处理24h时,3种马铃薯植株中P5CS和Pro DH基因的表达量均有所降低。