银屑病(psoriasis)是一种临床上常见的慢性复发性炎症性皮肤病,难以彻底治愈。其中,寻常型银屑病(psoriasis vulgaris)是银屑病中最常见的一种临床类型,主要发病人群为青壮年,并且皮损主要分布于肢体的暴露部位,如头皮、四肢伸侧等,影响患者的仪表形象,造成严重的心理负担。因而,有关银屑病的病因及发病机制研究一直是皮肤科领域的热点和难点之一。到目前为止,银屑病的病因、发病机制仍为阐明。目前的共识认为,银屑病是具有遗传易感性的个体在内、外环境因素的影响下,由T淋巴细胞介导的一种自身免疫性疾病。研究发现,表观遗传调控机制在系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中发挥着重要的作用,但有关银屑病的表观遗传调控研究报道较少。我们的课题组在先前的研究中发现DNA甲基化在寻常型银屑病外周血单一核细胞(PBMCs)和皮损组织中发生异常改变,这表明DNA甲基化可能是参与寻常型银屑病发病的重要发病机制之一。DNA甲基化(DNA methylation)是发现最早、研究最多的表观遗传调控机制之一,作为DNA的一种天然修饰方式广泛存在于各种生物体内。DNA甲基化是指DNA胞嘧啶第5位碳原子在DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的催化作用下,发生甲基(-CH3)修饰,形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。在整个基因组中,CG富集的区域称为CpG岛,通常以非甲基化形式存在于基因启动子区域(promoter region)内。一般来说,当某个基因发生DNA甲基化修饰后可导致该基因的表达沉默,而低甲基化(hypomethylation)(?)(?)能够促使该基因的表达增强。1977年,第一代测序技术——Sanger测序问世,并在之后的30年间成为应用最广泛的测序技术。2005年,以高通量、低成本为特点的第二代测序技术愈发成熟并形成商业化的规模。第二代测序技术(next generation sequencing, NGS)最显着的特征是高通量,即一次可以对几十万、甚至几百万条DNA分子序列进行测序,能够在短时间内完成一个物种的基因组深度测序,使细致、全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deep sequencing)。MeDIP-seq (Methylated DNA Immunoprecipitation sequencing)是通过5’-甲基胞嘧啶抗体与甲基化DNA发生免疫共沉淀反应,特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段,再结合NGS技术,从而快速、高效地寻找出基因组中发生甲基化改变的区域,用以比较不同细胞、组织、疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。因此,本课题拟通过对寻常型银屑病患者皮损区、非皮损区及正常人的皮肤组织进行全基因组DNA甲基化测序,以全面揭示甲基化改变在银屑病的发生、发展中所发挥的作用,进一步全面揭示DNA甲基化在银屑病的发病机制中的作用,填补相关研究领域的空白。第一部分寻常型银屑病患者皮损组织和非皮损组织DNA甲基化谱第一节寻常型银屑病患者皮损组织和非皮损组织DNA甲基化测序目的研究寻常型银屑病患者皮损组织、非皮损组织及正常健康对照者皮肤组织全基因组DNA甲基化状态,探讨DNA甲基化在寻常型银屑病发病中的作用和机制。方法提取4例寻常型银屑病患者皮损组织、非皮损组织和4例正常健康对照者皮肤组织中基因组DNA,并采用MeDIP-Seq测序技术对其进行DNA甲基化测序。结果通过MeDIP-seq测序,我们得到了达到足够测序深度和分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。甲基化发生异常改变的差异甲基化区域(DMRs)数量达到63,194个,整个测序结果的原始数据量达到了20.10Gb。和正常人皮肤组织相比,寻常型银屑病皮损组织全基因组DNA呈高甲基化状态,银屑病患者皮损区中呈高甲基化改变的基因DMRs数量(40,357个)远远多于低甲基化改变的基因DMR数量(22,837个)。GO分析显示甲基化异常改变明显的基因类型包括免疫系统类、细胞周期类和细胞凋亡类等。结论寻常型银屑病皮损组织全基因组DNA呈高甲基化状态。DNA高甲基化可能在寻常型银屑病发生、发展中起重要作用。第二节寻常型银屑病患者皮损组织和非皮损组织PDCD5和TIMP2基因调控序列甲基化水平研究目的选择PDCD5和TIMP2两个基因对寻常型银屑病患者皮损组织和非皮损组织DNA甲基化测序结果进行验证。方法选取10例寻常型银屑病患者(皮损组织和非皮损组织)和10例正常人皮肤组织作为研究对象,采用重亚硫酸氢盐测序法对基因PDCD5和TIMP2进行测序,以验证MeDIP-Seq结果。结果与正常皮肤组织相比,基因PDCD5在寻常型银屑病皮损区和非皮损区均呈高甲基化状态(0.806±0.058vs0.485±0.059,p=0.000；0.705±0.042vs0.495±0.059,p=0.000),与寻常型银屑病非皮损区相比,基因PDCD5在寻常型银屑病皮损区也呈高甲基化状态(0.806±0.058vs0.705±0.042,p=0.014)。基因TIMP2DMRs区域中(-1500bp～-1130bp)所有16个甲基化位点的平均水平总体无显著性差异。但是在连续6个密集的甲基化位点(-1399,-1406,-1420,-1434,-1443,-1454)处,与寻常型银屑病皮损区相比,TIMP2在寻常型银屑病非皮损区呈低甲基化状态(0.354±0.08vs0.664±0.04,p=0.000)；与正常皮肤组织相比,TIMP2在寻常型银屑病非皮损区也呈低甲基化状态(0.354±0.08vs0.557±0.14,p=0.011)。此外,相关性分析显示,基因PDCD5和基因TIMP2甲基化水平与寻常型银屑病患者PASI评分均呈正相关(PDCD5:r=0.717, p=0.020; TIMP2:r=0.763, p=0.010)。结论基因PDCD5和TIMP2重亚硫酸盐测序结果和MeDIP-Seq测序结果一致,且与寻常型银屑病患者PASI评分正相关。第二部分寻常型银屑病患者皮损区和非皮损区PDCD5和TIMP2基因表达及其与DNA甲基化相关性分析目的研究寻常型银屑病患者皮损区和非皮损区PDCD5和TIMP2基因表达及其与DNA甲基化相关性分析。方法采用Trizol法提取30例寻常型银屑病患者(包括皮损区和非皮损区)和20例正常对照者皮肤组织中的RNA,应用Real-timePCR法检测PDCD5和TIMP2mRNA表达水平,并对DNA甲基化和基因表达进行相关性分析。结果与正常皮肤组织相比,寻常型银屑病患者皮损组织中PDCD5mRNA表达水平显著降低(2.201±0.78vs2.914±1.08,p=0.013),非皮损区PDCD5mRNA表达水平亦有下降,但差异无统计学意义(2.774±1.03vs2.914±1.08,p=0.659)；与寻常型银屑病患者非皮损区相比,皮损区中PDCD5mRNA表达水平也显著降低(2.201±0.78vs2.774±1.03,p=0.025)。与正常皮肤组织相比,寻常型银屑病患者皮损组织中TIMP2mRNA表达水平降低,非皮损区TIMP2mRNA表达水平升高,两者均无统计学差异(1.340±0.69vs1.512±0.84,p=0.866；1.917±1.09vs1.512±0.84,p=0.156)；与寻常型银屑病皮损组织相比,寻常型银屑病患者非皮损区组织中TIMP2mRNA表达水平显着增高(1.917±1.09vs1.340±0.69,p=0.023)。相关性分析显示,PDCD5和TIMP2甲基化水平和其mRNA表达水平呈负相关(PDCD5:r=-0.709, p=0.022; TIMP2:r=-0.766,p=0.01)。结论寻常型银屑病患者皮损组织/非皮损组织中基因PDCD5和TIMP2mRNA表达水平异常,与DNA甲基化水平呈负相关。