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研究背景:根据世界卫生组织国际癌症研究中心发布的GLOBOCAN2012数据显示,癌症新增病例1410万,且致死病例820万。明显高于GLOBOCAN在2008年公布的数据,1270万新增癌症病例,致死病例760万,其中乳腺癌的诊断率排名第二位,仅次于肺癌,约占总比利的11.9%[1]。说明乳腺癌已成为阻碍人类健康生活的一大桎梏。仅2012年,全球乳腺癌有170万的新增病例,比2008的发病率增长超过20%,且病死率增长尽14%,可见其发展形势之严峻[1]。目前手术治疗、放疗、化疗及内分泌治疗为临床的经典治疗手段,但因乳腺癌的分型及病因的不同,无差别治疗对患者产生极大的副作用,也大大提高了乳腺癌的病死率。因此,从乳腺癌的病因出发,寻找特异性的靶向治疗药物及方案是医学界亟待解决的问题。大量研究发现从我国传统中草药中提取的天然产物具有高效低毒的抗肿瘤作用,其中从地衣植物中提取的松萝酸具有可抑制多种肿瘤的作用,且能减缓乳腺癌的生长,但其机制和通路尚不清楚[2,3]。研究目的:本论文研究松萝酸对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响及产生的机制,探讨松萝酸通过何种途径的调节作用,参与抑制乳腺肿瘤增殖,阐述松萝酸对体内抑制乳腺癌荷瘤发生发展的明确作用及其较好安全性的优势,为临床乳腺癌治疗药物的选择提供理论基础。研究内容:MTT法检测松萝酸对不同种系的乳腺癌细胞活性的抑制作用;流式细胞仪检测松萝酸诱导细胞凋亡作用;用DCFH-DA探针(DCFH-DA为氧化敏感的荧光探针DCFH-DA。它能穿过细胞膜进入细胞内,与ROS反应可转变为发出荧光的DCF。通过检测荧光强度可以间接反映细胞氧化应激的程度。)检测经松萝酸刺激后细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,Western blot方法检测松萝酸诱导细胞凋亡的相关蛋白的表达,用乳腺癌荷瘤裸鼠模型初步评价松萝酸的体内抗乳腺癌活性和安全性。研究方法与结果:1.松萝酸可通过ROS介导的线粒体凋亡途径特异性杀伤乳腺癌细胞不同浓度(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μM)松萝酸与三种乳腺癌细胞(人乳癌细胞系MCF-7、人三阴乳癌细胞系MDA-MB-231、人乳腺腺癌细胞系SK-BR-3)及正常乳腺细胞(正常乳腺上皮细胞MCF-10A)分别共培养24和48 h,MTT法检测松萝酸对乳腺癌细胞增殖的抑制现象;流式细胞仪检测松萝酸诱导MCF-7细胞凋亡情况;给予DCFH-DA探针后通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测MCF-7细胞经不同浓度(0、12.5、25、50μM)的松萝酸培养24 h后细胞内ROS水平的变化,同时用流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化,用试剂盒检测Caspase-3活性的变化;同时用ROS的抑制剂NAC(5 m M)验证松萝酸诱导的ROS产生对细胞凋亡的影响;并用JNK的抑制剂SP600125(5 m M)验证MAPK途径传导ROS介导凋亡信号的影响;用Western blot方法检测给药24 h细胞中JNK、c-Jun、ERK、Bax/Bcl-2、Cytochrome-c、Caspase-3和PARP的表达。结果表明松萝酸在MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3、MCF-10A细胞24 h时的IC50值分别为34.12±1.25μM、38.41±1.64μM、48.07±1.52μM、87.69±1.04μM,表明松萝酸可抑制乳腺癌细胞增殖,同时对正常的乳腺癌细胞毒性作用较小,但成时间或剂量依赖性的杀伤三种乳腺癌细胞。细胞凋亡率显著上升(P<0.05);DCFH-DA探针检测表明经不同浓度松萝酸培养24 h后的MCF-7中ROS的增加具有剂量依赖性,流式细胞仪检测表明松萝酸亦可增加细胞线粒体膜的通透性,Annexin V-PI双染色结果显示松萝酸作用24 h后MCF-7细胞的凋亡率较对照组显著增高,试剂盒检测表明松萝酸可显著增加Caspase-3的活性,Western blot检测结果显示JNK、Cytochrome-c、Caspase-3和PARP的表达显著上调,Bax/Bcl-2的比例显著升高,表明可松萝酸通过ROS介导的线粒体凋亡途径特异性杀伤乳腺癌细胞。我们进一步通过应用ROS的抑制剂NAC和JNK抑制剂SP600125可逆转松萝酸引起的MCF-7细胞凋亡作用,同时Western blot结果示Bax/Bcl-2、Cytochrome-c、Caspase-3、PARP表达有变化且能被NAC和SP600125逆转,均证明松萝酸可通过ROS激活MAPK途径再经线粒体凋亡途径,终而激活Caspase-3引起乳腺癌MCF-7细胞凋亡。2.从动物体内实验验证松萝酸对乳腺癌增殖的抑制作用。建立裸鼠动物模型,按治疗时所给药物浓度分为生理盐水组、25mg/kg松萝酸组、50mg/kg松萝酸组、100 mg/kg松萝酸组、25mg/kg环磷酰胺组,每3天测量一次肿瘤体积及裸鼠的体重。21天后处死裸鼠取出肿瘤,测量重量,并用TUNEL试剂盒检测肿瘤的凋亡情况。结果表明,松萝酸可显著抑制人乳腺癌荷瘤的生长曲线和重量,且抗肿瘤作用呈剂量依赖性,高剂量100mg/kg松萝酸组的抗肿瘤效果高于环磷酰胺组,且TUNEL染色结果进一步证实松萝酸可通过增强乳腺癌细胞的凋亡率而抑制荷瘤生长。从裸鼠的体重变化可以看出,经松萝酸治疗的裸鼠无论剂量大小其体重的增长与生理盐水组保持一致,而阳性药环磷酰胺组的裸鼠体重明显下降,表明松萝酸具备高效低毒的体内抗肿瘤作用。研究结论:松萝酸可通过产生大量的ROS,激活JNK蛋白,引起Bcl-2、Bax及细胞色素c的改变,从而不可逆的激活Caspase-3,从而通过线粒体介导的细胞凋亡途径导致乳腺癌细胞死亡,体内、外实验均表明松萝酸具有显著的抗乳腺癌作用,有望进一步开发为乳腺癌治疗药物。