研究背景：肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，尽管肿瘤的治疗方法取得了很大的进展，但是仍然有很多病人在治疗后复发或转移，或因反复用药产生耐药性。近年来，从天然植物中寻找抗肿瘤药物已经成为肿瘤治疗领域的一大热点。到目前为止，国内外学者已从苦瓜中分离纯化了数种核糖体失活蛋白，经研究证实这些蛋白质具有抗肿瘤活性，并且可以诱导肿瘤细胞凋亡。苦瓜中还存在其它生物活性蛋白有待进一步开发和利用。 目的：从苦瓜中分离纯化具有抗肿瘤活性的蛋白质，并对其作用机制进行初步的探讨。 方法：(1)将苦瓜种仁应用丙酮分级沉淀法制备苦瓜子蛋白粗提物，用Hiprep 16／10 SOURCE 30S阳离子交换层析和HiLoad 26／60 Superdex 75凝胶过滤分离纯化，纯化产物经SDS-PAGE和双向电泳，硝酸银染色鉴定纯度，SDS-PAGE测定苦瓜子蛋白的分子量，等电聚焦测定等电点。(2)应用人非小细胞性肺癌细胞株A549、人肝细胞性肝癌细胞株BEL-7402、人早幼粒细胞性白血病细胞株HL-60和小鼠淋巴瘤细胞株P388对从苦瓜子中分离纯化的14个组分的蛋白质进行体外抗肿瘤活性的初步筛选。悬浮培养的白血病细胞应用MTT法、贴壁生长的实体瘤细胞应用SRB法进行抗肿瘤活性的筛选。(3)对初筛显示较强抗肿瘤活性的苦瓜子蛋白HP2-751和HP3-751应用白血病、肺癌、肝癌、胃 汕头大学医学院博士学位论文 中文摘要 癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌等n个肿瘤细胞株进行体外抗肿瘤谱分析。（4） 将不同浓度的苦瓜子蛋白 HPZ－75、Ill，3．75和 HPS－75作用于人肝细胞性肝癌 BEL．7402细胞，应用流式细胞仪对BEL－7402细胞的DNA含量进行动态分析， 应用透射电镜观察BEL7402细胞超微结构的变化。 『结果：门）苦瓜子蛋白丙酮粗提物经阳离子交换和凝胶过滤后，共得到14 个组分的蛋白质，暂定名为pl－751、Ill，l－753、HPZ－751、HPZ－752、HP3－751、 HP3．752、HP3－753、HP4751、HPS．751、grs－752、HPS．753、HP6．751、HP6．752 和HP6．753。它们均为碱性蛋白，等电点在9刀．9．6之间，分子量在13－29KD之 间。苦瓜子蛋白 ffeZ－75和 HP3－75在双向电泳图谱中显示为单个斑点，可见 纯化的效果良好。（2）对从苦瓜子中分离纯化的！4种蛋白组分进行了体外抗肿 瘤活性的筛选，其中HPZ－75、HP3－75、HP3．753和HPS－751对人非小细胞性0 肺癌A549细胞、人肝细胞性肝癌BEL－7402细胞、人早幼粒细胞性白血病HL七0 细胞和小鼠淋巴瘤 p388细胞均有抑制作用，其汇。在 1石X10人2．4X10”’m。e （之间。不同的苦瓜子蛋白组分对不同的肿瘤细胞的抑制作用不同。人非小细胞 性肺癌A549细胞、人肝细胞性肝癌 BEL－7402细胞对 HPZ－75最为敏感，其n。 分别为7．6X 10bOCh和4．SX 10forrt。人早幼粒细胞性白血病HL七0细胞对 Hp5J 最为敏感，IC50为4．3X106moto。小鼠淋巴瘤p388细胞对Hp3刁 最 为敏感，IC扣为 1石X 10－6m。W。门）不同的肿瘤细胞株对苦瓜子蛋白 HPZ刁 和 HP3－75！的敏感性有所不同，对苦瓜子蛋白最敏感的肿瘤细胞株是人肺腺癌 SPCM，其ns。值分别为4．5 XIO“ho W opZ－75）和5．0 XIO枷ilL p3刁5卜对 HPZJ5和 HP3J5两种苦瓜子蛋白均不敏感的细胞株为人急性 淋巴母细胞性白血病MOLT4、人胃腺癌MKN28、人胃腺癌SGC－7901、人结 肠腺癌HCTll6和人乳腺癌MCF－7。人早幼粒细胞性白血病HL60、人非小细 胞性肺癌 A549和人肝细胞性肝癌 BEL－7402对苦爪子蛋白 HPZ－75和 HP3－7n 的敏感性介于两者H间，其 IC00值在 3．4 XI obeffel．0 XIO”’iOW之间。N） 2 汕头大学医学院搏士学位论文 中文摘要 苦瓜子蛋白诱导BEL7402细胞凋亡具有时间和剂量依赖性，随着剂量的增加， HPZ－75、HP3－75诱导 BEL－7402细胞凋亡率也随之升高，但是 HPS－75却呈 现下降趋势。在 3个苦瓜子蛋白组分中，HP3刁5！诱导 BEL7402细胞凋亡的能 力最强，分别加入0．5mghlll、0．25mglllll、0．125mtw的HI，3－751、HPZ－751和4”“”“’”“—“”””——”—一”“—”—”—一“”“—”—““一“一““””——－’—“”一“”—“·”－ ．0 HPS．75，BEL．7402细胞凋t率为HP3－75：90．gi％、80．47％和77．89％，明显 高于加入同等剂量的HPZ－751和pps－751（BEL－7402细胞凋亡率分别为 50?