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目的利用酵母双杂交技术了解phb2与CLIC1之间的相互作用;构建带FLAG标签的phb2真核表达载体和带GFP标签的CLIC1真核表达载体;将其共转染至COS7细胞,观察其在细胞内的共定位的情况;转染至HEK293T细胞,通过免疫共沉淀,检测在哺乳动物细胞内phb2蛋白与CLIC1蛋白的相互作用情况。方法以含人phb2全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb2为模板,用PCR方法扩增phb2全长序列,双酶切后回收目的片段,连接到载体pGADT7上,构建表达载体pGADT7-phb2;用PCR方法扩增phb2全长序列,双酶切回收目的片段,连接到载体pGBKT7上,构建表达载体pGBKT7-phb2;以pACT2-CLIC1为模板,用PCR方法扩增CLIC1全长序列,BamHⅠ单酶切回收目的片段,连接到载体pGBKT7上,构建表达载体pGBKT7-CLIC1 ;同样方法构建表达载体pGADT7-CLIC1。把测序正确的酵母表达载体分组转化至酵母菌AH109,在SD/-Leu/-Trp/-His/+3-AT/X-α-gal盘上筛选蓝色的克隆。呈蓝色的克隆是α-半乳糖苷酶活性为阳性的克隆,即两种蛋白相互作用的克隆,再通过滤膜印迹实验测定β-半乳糖苷酶活性进一步验证它们的相互作用情况。用PCR方法扩增phb2全长序列构建真核表达质粒pCDNA3-FLAG-phb2,转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位;将构建正确的质粒pCDNA3-FLAG-phb2和pCDGFP-CLIC1共同转染至COS7细胞,通过免疫荧光的方法观察phb2蛋白与CLIC1蛋白在细胞内的共定位情况;将质粒pCDNA3-FLAG-phb2和pCDGFP-CLIC1共同转染至HEK293T细胞,提取细胞裂解液,做免疫共沉淀,通过Western blot检测在哺乳动物细胞内phb2蛋白与CLIC1蛋白的相互作用情况。结果经酶切和测序鉴定,各组载体均构建正确。营养筛选及α,β-半乳糖苷酶活性的测定结果表明phb2蛋白和CLIC1蛋白存在相互作用;pCDNA3-FLAG-phb2和pCDGFP-CLIC1共转染至COS7细胞中,免疫荧光显微镜观察phb2和CLIC1在胞质内存在明显的共定位;免疫共沉淀和Western blot检测证明phb2蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T细胞中存在相互作用。结论酵母双杂交的结果表明了phb2蛋白和CLIC1蛋白之间存在相互作用;免疫荧光显微镜观察pCDNA3-FLAG-phb2和pCDGFP-CLIC1在COS7细胞中存在共定位;免疫共沉淀和Western blot检测进一步证明了phb2蛋白和CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。