背景与目的:脑出血是由小血管出血引起的脑实质内血肿,是中风中常见和致命的卒中亚型。由于脑出血后脑损伤导致的死亡率和发病率居高不下,因此脑出血严重威胁着我国公众健康。虽然近年来在利用动物实验研究及在人类开展临床研究上针对脑出血的防治取得了长足的进步,但目前仍然缺乏有效的针对脑出血的治疗策略。脑出血最初发生血管的损伤,紧接着出现血脑屏障功能的损伤破坏等继发性损伤。在急性脑出血后的继发性脑损伤中,血脑屏障的破坏是脑出血所致脑损伤的重要标志,是脑出血后脑继发性损伤的一个最重要的病理生理变化。脑出血引起的血脑屏障通透性增加,在脑出血后的继发性损伤中持续发挥重要作用。血脑屏障通透性的增加包含旁细胞途径(紧密连接功能的改变)和/或跨细胞途径(囊泡转运)这两种方式。许多研究已经表明,脑出血后血脑屏障功能障碍存在多种因素的共同作用,包括凝血酶、纤维蛋白、红细胞成分,和炎性分子浸润导致的炎症反应等。因此,对脑出血后血脑屏障的保护治疗是非常迫切的,对血脑屏障的保护是脑出血后早期脑损伤防治的一个新的疾病控制策略。主要促进因子超级家族的一个成员(Mfsd2a),既往因为是钠依赖性溶血磷脂酰胆碱转运体1而被熟知,在人类体内是由Mfsd2a基因编码的蛋白质。既往的研究表明,Mfsd2a是一种膜转运蛋白,Mfsd2a也被认为可能是负责转运衣霉素的蛋白,它选择性的表达在血管内皮细胞,在血脑屏障的形成和功能中有重要作用。Mfsd2a在维护血脑屏障的完整性方面有重要作用,然而,目前尚不清楚其蛋白功能是否参与了脑出血后早期脑损伤的病理生理过程,尤其在血脑屏障损伤方面是否具有作用还并不清楚。因此,在本研究中,我们的目的是探讨Mfsd2a蛋白在脑出血后继发性损伤特别是血脑屏障损伤中的功能作用。我们发现,Mfsd2a在脑出血后脑血管内皮细胞表达降低,其可增加血脑屏障的脑血管通透性、脑水肿和神经功能缺损评分,而当Mfsd2a表达增加后,脑血管通透性、脑水肿和神经功能缺损评分的增加在一定程度上可以被逆转,我们的实验结果表明,脑血管内皮细胞表达的Mfsd2a可能通过抑制血管囊泡转运从而保护因脑出血引起的血脑屏障损伤特别是血脑屏障通透性的破坏,从而维护大脑中微环境的稳态。方法:第一部分脑出血后Mfsd2a表达变化1.构建自体血脑出血模型,分别于12小时,1天,3天,5天和7天处死小鼠,取出血半球脑组织提取蛋白。采用Western Blot方法分别检测分析血肿周围组织中的Mfsd2a的表达。2.我们利用Western blot方法检测小鼠脑出血后血肿周围脑组织中Mfsd2a在24、48及72小时3个时间点的表达情况,并与小鼠脑出血假手术组及空白对照组中的Mfsd2a表达进行比较并分析Mfsd2a表达与不同时间点变化趋势的关联性;通过免疫荧光观察Mfsd2a在脑组织中的表达,明确其在脑出血后的表达情况和规律性。第二部分使用Mfsd2a si RNA转染小鼠使Mfsd2a表达进一步下降,增加了血脑屏障通透性,并加重了脑出血后神经功能缺损1.运用基因工程技术构建Mfsd2a Si RNA并转染小鼠脑组织后,采用Western Blot方法检测野生小鼠脑组织中Mfsd2a含量在不同时间点的表达。在Mfsd2a si RNA转染小鼠并证实能使Mfsd2a的表达进一步下降,再使用这种Mfsd2a表达下降的小鼠构建自体血脑出血模型,分别于12小时,1天,3天,5天和7天处死小鼠,取出血半球脑组织提取蛋白。采用Western Blot、免疫荧光分别分析血肿周围组织中的Mfsd2a的表达。2.通过调控Mfsd2a的表达和活性改变,通过神经功能缺损评分、干湿重法测定脑组织含水量、伊文思蓝法检测血脑屏障通透性,观察脑出血后Mfsd2a的表达变化较单纯脑出血组在24、48及72小时3个时间点是否增加了血脑屏障损伤,并探讨Mfsd2a对血脑屏障作用可能的分子机制。第三部分构建Mfsd2a基因敲除小鼠,增加了脑出血后血脑屏障通透性及脑出血后神经功能缺损1.利用CRISPR/Cas9技术制备Mfsd2a基因敲除小鼠,通过免疫荧光、Western Blot验证Mfsd2a基因敲除小鼠是否有Mfsd2a表达。2.用Mfsd2a敲基因小鼠构建自体血脑出血模型,通过神经功能缺损评分、干湿重法测定脑组织含水量、伊文思蓝法检测血脑屏障通透性。第四部分运用基因工程技术构建Mfsd2a腺相关病毒表达载体转染小鼠并成功增加了Mfsd2a表达,降低了脑出血后血脑屏障通透性及脑出血后神经功能缺损1.运用基因工程技术构建Mfsd2a AAV,转染小鼠脑组织后,采用Western Blot检测小鼠不同时间点Mfsd2a的表达。使用Mfsd2a AAV转染后的小鼠构建自体血脑出血模型,分别于12小时,1天,3天,5天和7天处死小鼠,取出血半球脑组织提取蛋白。采用Western Blot、免疫荧光分别检测分析血肿周围组织中的Mfsd2a的表达。2.Mfsd2a AAV转染小鼠脑组织使Mfsd2a的表达上调后,通过神经功能缺损评分、干湿重法测定脑组织含水量、伊文思蓝法检测血脑屏障通透性,探讨脑出血后Mfsd2a的表达变化较单纯脑出血组在24/48/72小时各时间点是否降低血脑屏障损伤,并分析其时间相关性及其分子机制。第五部分利用电镜、Western Blot、多重反应监测(MRM)分析Mfsd2a的在小鼠血脑屏障中的作用机制1.采用Western Blot检测WT、Mfsd2a-/-、WT+control AAV和WT+Mfsd2a AAV小鼠脑出血后脑组织中的内皮连接蛋白ZO-1,Claudin-5,Occludin,and VE-Cadherin的表达。2.采用电镜观察分析WT、Mfsd2a-/-、Mfsd2a AAV小鼠脑组织及脑出血后血肿周围脑组织血管内皮微结构。3.采用MRM分析WT、Mfsd2a-/-小鼠脑出血后脑组织中与囊泡转运相关的蛋白的表达变化。结果:1.正常野生小鼠脑出血后Mfsd2a蛋白表达下降;2.使用Mfsd2a Si RNA转染野生小鼠大脑,使得小鼠Mfsd2a表达进一步降低,Mfsd2a表达降低后的小鼠构建自体血脑出血模型发现增加了血脑屏障通透性,并加重了脑出血后神经功能缺损;3.敲除Mfsd2a基因后的小鼠,脑出血后血脑屏障通透性及脑出血后神经功能缺损显著增高;4.Mfsd2a腺相关病毒表达载体转染小鼠增加Mfsd2a表达,降低了脑出血后血脑屏障通透性及脑出血后神经功能缺损;5.WT、Mfsd2a-/-、WT+control AAV和WT+Mfsd2a AAV小鼠在脑出血后,内皮连接蛋白ZO-1,Claudin-5,Occludin,and VE-Cadherin的表达未有明显差异;电镜发现Mfsd2a-/-及Mfsd2a-/小鼠-脑出血后转运囊泡增加,而使用Mfsd2a AAV转染小鼠大脑使得Mfsd2a表达上调后,脑出血后转运囊泡未见明显增加;使用MRM分析WT、Mfsd2a-/-小鼠脑出血后脑组织中部分囊泡转运蛋白的含量,发现可能与Srgap2,Stx7和Sec22b这三种蛋白的表达变化有关。上述研究提示Mfsd2a在维护脑出血后血脑屏障的功能完整性中具有重要作用,在脑出血所致的血脑屏障损伤中,可能通过抑制血管囊泡转运的途径从而减少血脑屏障的通透性来实现对血脑屏障功能的保护作用。