结直肠癌是全球发病率排名第三的肿瘤,其病死率也高居第三位。然而,肿瘤的发生发展是个缓慢多阶段的过程,是多个因素逐步叠加综合作用的结果。对于结直肠癌病变过程来说,它也具有阶段性的特征,粘膜上皮常常要经历增生、不典型增生、异型增生和癌变这几个阶段,形态学上的改变就是粘膜息肉、腺瘤低级别病变、腺瘤高级别病变和癌。在这病变过程中,目前已知有多种抑癌和促癌基因参与,比如APC基因的纯合型突变失活被认为是结直肠肿瘤的首要促发因素,在结直肠腺瘤样本中大多数都可以检测到APC基因的失活。APC基因失活后可以导致细胞内β-catenin降解系统功能障碍,不能正常降解细胞内多余的β-catenin片段,导致β-catenin在细胞内的集聚并入核,与TCF4形成结合复合物,启动下游一系列靶基因的表达,Wnt通路活化。其他参与的突变基因有Kras,P53,DCC等。有关结直肠癌的发病机制也是众多学者研究的热点,大家都想弄清楚是什么导致了结直肠癌的发生?哪些因素在这个病变过程中起着主导作用?上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)自 1980年代Elisabeth在对鸡胚的研究中首先观察到并描述了这一现象开始,逐渐成为研究的热点。上皮细胞失去上皮细胞表型获得间质表型,具有了运动能力的过程就是EMT。它在胚胎发育和创伤愈合以及肿瘤的浸润和转移过程中的发挥着重要作用,大致包括三种类型:Ⅰ型,胚胎发育过程中的EMT;Ⅱ型,创伤愈合及器官纤维化过程中的EMT;Ⅲ型,恶性肿瘤侵袭和转移过程中的EMT。三者的调节通路有着相似性,但是又各具自己的特点。其中以EMT在恶性肿瘤的浸润和转移过程中所扮演的作用最为人们所关注,结直肠癌是常见的消化系统肿瘤,因此,EMT在结直肠肿瘤发生发展过程中的作用也日益受到重视。2012年,Rhim等通过特异性标记转基因小鼠的胰腺上皮,示踪性追溯胰腺上皮细胞的癌变的过程发现在胰腺上皮内瘤变的阶段就出现EMT的改变,并且部分内瘤变的上皮细胞可以在肝脏组织内检测到,提示EMT和转移可以在胰腺癌发生之前就出现。这一研究成果给我们提供了一个很好的研究方向:在结直肠病变的不同阶段是否存在EMT?它有着怎样的变化特点?在结直肠癌发展过程中有哪些基因发生改变?它们是否在结直肠癌的发生发展过程中起着重要作用?因此,本论文研究目的是研究结直肠肿瘤中的EMT现象及通过结直肠癌突变基因筛查找到与结直肠癌发生相关的机制。1.结直肠癌发展过程中的EMT改变我们用免疫组化的方法检测了 105例腺瘤低级别组织,112例腺瘤高级别组织以及69例结肠粘膜组织,71例配对的肠癌原发灶和肝转移灶组织中EMT标志物(E-cadherin、Vimentin、β-catenin和L1CAM)的表达,发现这些标志物的表达水平随着肿瘤病变的进展呈现出波动性的变化。上皮性标志物随着结肠粘膜向腺瘤低级别直至高级别发展时表达水平逐渐下降。而间叶性标志物的表达水平则呈逐步升高的趋势。提示EMT贯穿结直肠病变发展的始终。当结直肠病变进展为癌时,肿瘤内的组织具有异质性,说明在肿瘤的生长过程中不同区域的肿瘤组织有着不同的组织形态和生物学行为。依次,我们将肠癌原发灶划分为肿瘤主体,肿瘤前缘和肿瘤芽三部分,肝转移灶划分为肿瘤中央,肿瘤与肝组织交界区以及肿瘤与肝组织交界区游离的肿瘤细胞三部分,然后观察EMT标志物在这些区域内的表达情况。我们发现,随着肿瘤从主体向前缘推进,EMT间叶性标志物的免疫组化表达水平越来越高,当肿瘤转移到肝脏后,从肿瘤中央到交界区再至交界区游离的肿瘤细胞,EMT标志物的表达也呈和原发灶相似的改变,但整体的表达水平较原发灶低。说明EMT在结直肠病变过程中的不同阶段和部位表达水平是不同的,它与病变的进展密切相关。2.结直肠癌发病过程中的表观遗传学改变和基因筛查我们从表观遗传和基因组突变两个方面来探讨结直肠癌发病的机制。通过提取肠癌组织的DNA,我们首先检测了这些样本中总体的甲基化和羟甲基化表达水平的改变发现肠癌原发灶和肝转移灶中甲基化表达水平高于配对的结肠粘膜组,而羟甲基化表达水平则是肠癌原发灶和肝转移灶中略低于配对的结肠粘膜组。肝转移灶的甲基化水平与淋巴结转移有相关性,羟甲基化水平与性别相关;肠癌原发灶的羟甲基化水平与性别和组织学分级相关。并且,肠癌原发灶的羟甲基化水平与预后关系密切,高表达组的患者预后较低表达组预后好。EMT标志物中结肠粘膜的E-cadherin的表达水平与DNA羟甲基化,肠癌原发灶和肝转移灶中β-catenin膜与DNA甲基化之间表达有明显相关性。此外,我们还检测了肠癌组织的微卫星不稳定状态,只发现一例患者存在微卫星不稳定,大部分属于微卫星稳定状态。另外,通过肠癌组织DNA外显子测序,比对肠癌组织与配对粘膜DNA的SNP和Indels,我们发现筛选出的突变基因多为参与细胞代谢及与细胞运动相关的基因。通过通路富集,我们发现了一条共有的ECM-receptorinteraction通路与结直肠癌的病变进展密切相关。综合以上研究结果,我们得到以下结论:1、EMT现象贯穿结直肠癌发展的整个过程,并随着肿瘤的进展阶段不同而呈现出不同的变化特点。说明EMT在结直肠癌病变的发展过程中起着主导作用,可以为临床早期病变的筛查和发病风险评估提供研究基础。2、肠癌组DNA羟甲基化表达水平越高,预后越好,可以作为一个判断临床预后的指标。3、结直肠癌基因突变集中在细胞代谢与浸润迁徙方面,可能参与EMT的调控过程,与结直肠癌转移密切相关。