先天性全身脂肪营养不良II型(congenital generalized lipodystrophy type 2,CGL2)的临床特征是全身脂肪组织减少和脂糖代谢异常,伴有认知功能障碍或精神发育迟滞。11号染色体长臂的seipin基因无义突变(seipin缺失)被认为是CGL2的主要病理机制。原位杂交和免疫染色的检测结果显示,seipin在大脑皮层、海马、下丘脑、脑干和小脑等脑区选择性高表达。海马锥体神经元和星型胶质细胞大量表达seipin蛋白。通过构建神经系统选择性seipin基因敲除(seipin-KO)小鼠,我们发现神经元的seipin缺失并没有改变脑的结构,也没有减少海马锥体神经元数量。我们课题组最近的研究已报道,seipin缺失抑制过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的表达。PPARγ是一种配体激活型转录因子。有研究报道,PPARy下调可以增强脑内神经细胞的炎性反应。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以记忆丧失和认知功能衰退为主要临床症状的神经退行性疾病。AD脑的PPARy水平明显减少,PPARy激动剂能减轻β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)诱导的神经炎症和细胞损害。此外,AD脑中PPARγ介导的抗炎作用受到越来越多的关注。基于以上分析,我提出"神经系统seipin缺失引起的PPARγ表达下调有可能会增强Aβ的神经毒性作用"的科研设想。研究目的本研究将重点探讨神经系统seipin缺失对Aβ诱导神经炎症和细胞毒性的影响及其分子机制。实验方法(1)动物模型的制备和鉴定:神经系统seipin-KO小鼠模型由北京大学医学院刘国庆教授提供。提取尾部DNA,用PCR方法鉴定基因型。(2)AD动物模型的制备:选取16周龄seipin-KO和野生型(wild-type,WT)雄性小鼠,采用聚集态 Aβ25-35(1.2nmol/2μl)或 Aβ142(0.1nmol/2μl)进行侧脑室注射。实验小鼠分组:WT小鼠,注射Aβ25-35的WT(Aβ25-35-WT)小鼠,注射Aβ142的WT(Aβ1-42-WT)小鼠,seipin-KO小鼠,注射Aβ25-35的seipin-K(Aβ25-35-seipin-KO)小鼠和注射 Aβ1-42 的seipin-KO(Aβ1-42-seipIn-KO)小鼠。对照组小鼠侧脑室内注射相同容积的溶剂。(3)动物行为学检测:采用Morris水迷宫和Y迷宫实验评估小鼠的空间认知功能。(4)用甲苯胺蓝染色来进行海马CA1区锥体神经元计数。(5)用GFAP或Iba1与seipin进行免疫组织双染色以确定seipin在星型胶质细胞和小胶质细胞中的表达。进行海马CA1区GFAP或Iba1阳性细胞计数。(6)用酶联免疫吸附试验检测海马的神经炎性因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。(7)用蛋白免疫印记方法来检测海马的糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasekinase-3β,GSK-3β)Tyr216位点磷酸化和Ser9位点磷酸化水平、信号传导子和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3蛋白和磷酸化水平、PPARγ蛋白水平。实验结果(1)与WT小鼠相比,seipin-KO小鼠在Morris水迷宫实验中登台潜伏期明显延长,撤台后在目标象限时间减少,以及在Y迷宫的进臂交替率降低——提示神经系统seipin缺失导致认知功能减退。(2)用低剂量Aβ25-35(1.2 nmol/2μl)进行侧脑室注射没有改变WT小鼠在Morris 水迷宫的登台潜伏期和目标象限的停留时间,以及在Y迷宫的进臂交替率,但是进一步加重了 seipin-KO小鼠在Morris水迷宫的登台潜伏期延长和撤台后目标象限停留时间的减少,以及Y迷宫进臂交替率的降低——提示seipin缺失能加重Aβ诱导的认知功能损害。(3)与WT小鼠相比,seipin-KO小鼠海马PPARy蛋白水平明显减少。PPARy激动剂罗格列酮处理不仅能改善seipin-KO小鼠的空间认知功能,还能阻止Aβ25-35/1-42处理seipin-KO(Aβ25-35/1-42-seiPIn-KO)小鼠发生认知功能损害——提示seipin缺失通过减少PPARγ增强Aβ对认知功能的损害作用。(4)与WT小鼠相比,seipin-KO小鼠海马CA1区锥体神经元数量没有明显改变。低剂量Aβ25-35或Aβ1-2(0.1 nmol/2μl)侧脑室注射引起seipin-KO小鼠发生大约30-35%锥体神经元丢失和Hoechst染色阳性细胞增加,但是没有减少WT小鼠的锥体神经元数量。罗格列酮处理能减少Aβ25-35或Aβ1-42诱导seipin-KO小鼠的锥体神经元死亡。PPARγ阻断剂GW9962能拮抗罗格列酮对Aβ25-35诱导锥体神经元死亡的保护作用——提示seipin缺失通过减少PPARγ增强Aβ神经毒性作用。(5)在WT小鼠,海马CA1区星型胶质细胞表达seipin,而小胶质细胞不表达seipin。与WT小鼠相比,seipin-KO小鼠海马CA1区星型胶质细胞和小胶质细胞数量没有明显改变,但是炎性因子IL-6和TNF-α 水平有增加。罗格列酮处理能抑制seipin-KO小鼠IL-6和TNF-α水平增加。GW9962又能拮抗罗格列酮的抗炎作用——提示seipin缺失通过减少PPARγ诱导神经炎性反应。(6)低剂量Aβ25-35或Aβ1-42侧脑室注射引起seipin-KO小鼠星型胶质细胞和小胶质细胞数量增加,并且进一步提高seipin-KO小鼠IL-6和TNF-α水平,但是不影响WT小鼠的星型胶质细胞和小胶质细胞数量、IL-6和TNF-α水平。同样,罗格列酮处理能抑制Aβ25-35或Aβ1-42诱导的seipin-KO小鼠星型胶质细胞和小胶质细胞数量以及IL-6和TNF-α水平增加。GW9962也能阻止罗格列酮对Aβ25-35诱导炎性反应的拮抗作用——提示seipin缺失通过减少PPARγ能增强Aβ的致炎作用。(7)与WT小鼠相比,seipin-KO小鼠海马GSK-3β在Tyr216位点的磷酸化水平升高和在Ser9位点的磷酸化水平降低,提示GSK-3β活性增强。罗格列酮处理能修正seipin-KO小鼠GSK-3β活性增强。Aβ25-35能提高WT小鼠的GSK-3β在Ser9位点的磷酸化水平。Seipin-KO小鼠海马的STAT3磷酸化水平高于WT小鼠,但是罗格列酮处理进一步增加了seipin-KO小鼠STATT3磷酸化——提示seipin缺失通过减少PPARγ能增加GSK-3β活性。结论Seipin缺失通过减少星型胶质细胞的PPARy能提高GSK-3β活性,增加IL-6及TNF-α的产生和释放,促进Aβ诱导的神经炎症和细胞毒性作用,引起认知功能损害。临床意义本研究的结果提示CGL2患者的认知功能障碍可能与PPARγ水平降低有关,因此,PPARγ激动剂有可能会改善CGL2患者的认知功能。