研究背景和目的:化学药物治疗是当今肿瘤关键治疗手段之一。肿瘤细胞对抗癌药物的耐药问题是导致肿瘤化疗失败的常见因素和关键性难题。大多数肿瘤患者的死因直接或间接与耐药相关。以实体瘤为主攻对象研究实体瘤化疗耐药的分子机制将是非常有意味和挑战性的工作,当今抗肿瘤药物的研究与开发已进入一个崭新的时代,抗肿瘤药物正从传统的细胞毒性药物,向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。这其中包括以细胞信号分子为靶点的基础研究。目前,大量研究认为肿瘤微环境在诱导肿瘤获得性耐药和抵抗细胞凋亡的生理性调节中发挥了重要作用。肿瘤微环境的特殊生态位可能为肿瘤细胞亚群在暴露于化疗药物之后提供了一个“避难所”,即一种生存优势。实体肿瘤的微环境包括细胞因子,生长因子,激素,低PH,低氧和各种细胞外基质等。其中纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)是很重要的细胞外基质,与肿瘤细胞粘附分子受体结合,对细胞的生长、分化、移动等过程具有重要的调节作用。本项目选择模拟体内环境的三维的细胞群集体的粘附耐药模型,从实体瘤微环境的角度来研究肿瘤耐药的发生机制,以Akt2介导的凋亡耐药的信号转导分子为靶点,探讨细胞凋亡与肿瘤耐药关系。方法:1、建立粘附耐药模型(1)体外三维培养建立粘附耐药模型和低氧诱导建立低氧耐药模型:受试细胞分别为卵巢癌细胞A2780、SKOV3细胞和乳腺癌细胞MCF-7、MDAMB231细胞等细胞(2)运用紫杉醇、顺铂等临床一线,二线化疗药物分别处理模型细胞和对照细胞, MTT法检测细胞增殖率;Hoechst- 33258染色,Annexin V -PI染色检测细胞凋亡率;以检测耐药模型的药物敏感性。2、验证AKT2在粘附耐药中的作用(1)Western-blot、免疫沉淀法检测在粘附耐药模型中AKT2的表达和活性。(2)用AKT2的上游分子PI3K的抑制剂ly294002处理各组细胞,观察其药物敏感性,初步验证AKT2在粘附耐药中的作用。(3)构建AKT2全长正义cDNA真核表达载体。(4)构建AKT2 shRNA真核表达载体。(5)分别将上述载体和各自对照载体转染细胞,稳定筛选。然后建立耐药细胞模型,化疗药物处理这些细胞,RT-PCR检测基因沉默效率,光镜、电镜、confocal和荧光显微镜对比细胞形态变化,流式细胞仪AnnexinV-PI法检测细胞凋亡率。以进一步验证AKT2在耐药中的作用。3、短发卡状RNA诱导Akt2基因沉默在粘附耐药中的应用研究(1)高效shRNA载体的改建:针对本室保存的shRNA真核表达载体pEGFP-C1-U6中U6启动子序列,构建可以同时插入3个目的片段的shRNA表达载体, (2)设计三对针对Akt2基因的反向重复序列,选择19nt的目的序列――LOOP碱基――反向重复序列及其互补链。(3)建立针对Akt2基因的三种基因沉默方法:单位点基因沉默法;双位点基因沉默法;三位点基因沉默法。(4)FACS检测紫杉醇的敏感性4、研究耐药模型中,AKT2介导的存活通路对survivin蛋白的调节作用(1)构建survivin全长正义cDNA真核表达载体,转染细胞(。2)Western-blot检测survivin蛋白表达、流式细胞仪AnnexinV-PI法检测细胞凋亡率。验证survivin的凋亡抑制作用,化疗药物对survivin蛋白表达的调节(。3)稳定转染AKT2全长正义cDNA真核表达载体,AKT2 shRNA真核表达载体。化疗药物处理细胞,Western-blot检测survivin蛋白表达。观察化疗药物对survivin蛋白表达的调节作用5、研究耐药模型中,AKT2介导的存活通路对P38凋亡通路的抑制作用,以探讨AKT2介导实体瘤耐药的分子机制。(1)构建P38全长正义cDNA真核表达载体。(2)用化疗药物处理对照细胞和模型细胞,提取蛋白,western blot分析AKT2、ASK1、JNK、P38总蛋白、磷酸化蛋白的表达。(2)分别转染AKT2正义全长载体和shRNA载体,稳定筛选。用筛选后的细胞建立模型,化疗药物处理细胞,提取蛋白,western-blot分析AKT2、ASK1、JNK、P38总蛋白、磷酸化蛋白的表达。(3)药物处理模型细胞和对照细胞,提取蛋白。用AKT2的抗体沉淀蛋白,然后进行Western blot分析,检测ASK1P38蛋白的表达,以明确他们和AKT2之间是否存在相互作用。结果:1、两株人卵巢癌细胞株和两株人乳腺癌细胞株接种在FN-coated孔板上,可以抵抗化疗药物诱导的凋亡,是最佳的耐药模型。本实验成功建立了模拟体内环境的三维的细胞群集体的粘附耐药模型。2、活化(磷酸化)的Akt2促进肿瘤细胞化疗耐药;细胞与FN的粘附可以上调Akt2并导致Akt2的活化;细胞与FN的粘附可以上调Akt2并导致Akt2的活化。3、高效shRNA载体构建成功(shRNA-p3);将针对同一基因的三对片断同时插入一个载体,稳定筛选后可以达到很高的沉默效率。在粘附耐药中,Akt2起了关键性的作用。阻断Akt2的表达;抑制了Akt2的活性,可以逆转化疗耐药。4、Surivin高表达导致细胞对多西紫杉醇的敏感性降低;多西紫杉醇可以通过下调细胞内Surivin的表达诱导细胞凋亡;细胞-FN粘附介导的PI3K/Akt2信号途径的激活可以阻断多西紫杉醇对Surivin表达的下调。5、活化的Akt2可以抑制化疗药物对P38死亡通路的激活;FN/Akt2信号通路对p38信号通路有抑制作用。且Akt2蛋白对P38蛋白的抑制作用是间接的,其中间分子是ASK1。结论:1、细胞-FN粘附可以模拟肿瘤微环境,建立粘附耐药模型。2、粘附耐药的分子机制与PI3K/Akt2通路的激活有关。3、高效shRNA载体构建成功,可以同时插入3个目的序列,达到高效省时的基因沉默效果。在粘附耐药中,Akt2起了关键性的作用。4、化疗药物是通过下调survivin的表达来诱导细胞凋亡的。Akt2可以抑制化疗药物对survivin蛋白的下调。5、FN/Akt2存活信号通路对p38凋亡信号通路有抑制作用,其中间分子是ASK1。