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研究背景:恶性肿瘤目前是严重危害人类生命健康的主要疾病之一。它具有细胞无限复制、持续的增殖信号、诱导血管生成、细胞凋亡抵抗、易侵袭转移和无限制增长等特点。放射治疗作为临床常用肿瘤治疗的三大主要方式之一,在治疗肿瘤,缓解患者痛苦,延长生存期方面起着重要的作用。放疗增敏剂的使用可以使同等剂量射线对肿瘤细胞造成更大的损伤,在提高肿瘤放射治疗疗效方面作用显著。高原子序数元素组成的无机纳米颗粒本身就是良好的放疗增敏剂。修饰了长链PEG的金纳米颗粒具有出色的生物相容性、稳定性、惰性和极低的细胞毒性,近年来被广泛地应用于生物医学研究领域。相比于大尺寸金纳米颗粒,小尺寸金纳米颗粒在EPR效应作用下更易被肿瘤所摄取,但由于体积较小同时也存在容易被机体清除的弊端。因此,延长小尺寸金纳米颗粒在机体的血循环周期,提高其在肿瘤病灶的富集量是提高肿瘤诊疗效果的有效途径。目前常用方法是在颗粒表面修饰特定响应性分子,使之在如pH、酶、光等刺激体的作用下可以在肿瘤内选择性聚集成颗粒聚集体,提高纳米颗粒在肿瘤内的积聚和滞留时间。本论文通过在小尺寸金纳米颗粒(25 nm)表面修饰叶酸受体靶向叶酸分子,提高纳米颗粒的肿瘤主动靶向性,通过在纳米颗粒表面引入蛋白质次磺酸反应基团3,5-二氧代环己烷羧酸(DHCA)实现金纳米颗粒的肿瘤锚定,增加探针在肿瘤病灶的积聚并延长其滞留时间,提高肿瘤的CT成像和放疗效果。研究目的:本论文通过在金纳米颗粒表面修饰肿瘤靶向叶酸分子(FA)和蛋白质次磺酸反应性3,5-二氧代环己烷羧酸,构建一种蛋白质次磺酸反应型肿瘤靶向金纳米探针一dAuNPs-FA,利用叶酸提高探针对肿瘤的主动靶向性,通过与肿瘤微环境高浓度蛋白质次磺酸发生交联,提高金纳米颗粒在肿瘤的积聚与滞留时间,进而实现增强肿瘤CT成像和放射增敏治疗。研究方法:(1)运用经典的柠檬酸三钠还原法制备尺寸均匀的金纳米颗粒,表面修饰SH-PEG5000-NH2,通过酰胺化反应将3,5-二氧代环己烷羧酸和叶酸分子修饰于金纳米颗粒表面。利用动态光散射仪、紫外光谱仪和傅里叶红外光谱仪对纳米进行表征;(2)采用动态光散射仪、透射电镜考察过氧化氢作用下金纳米颗粒与牛血清白蛋白BSA的交联情况;(3)利用动态光散射仪和紫外光谱仪测定dAuNPs-FA在不同溶剂中的稳定性;(4)通过MTT法分别评价dAuNPs和dAuNPs-FA对小鼠胚胎成纤维细胞3T3,小鼠胃癌细胞MFC和人源胃癌细胞MKN-45的毒性;(5)通过暗场显微镜、电感耦合等离子体高分辨质谱仪和γ-H2AX识别抗体免疫荧光法考察dAuNPs与不同浓度过氧化氢预处理过的4T1细胞的交联效果;(6)通过暗场显微镜观察和定量细胞对dAuNPs-FA和dAuNPs的摄取;(7)通过细胞周期实验分别验证dAuNPs和dAuNPs-FA对细胞周期的阻滞作用;(8)通过Live/Dead实验、细胞凋亡实验、γ-H2AX识别抗体免疫荧光法、单细胞凝胶电泳实验、克隆形成实验考察dAuNPs-FA锚定于4T1细胞后的放射增敏效应;(9)通过CT成像和透射电镜评估dAuNPs-FA锚定于肿瘤后引起的长滞留效应;(10)对比考察dAuNPs-FA与AuNPs-FA在4T1荷瘤小鼠体内的放射治疗效果,通过肿瘤的体积变化、转移情况和组织切片分析对肿瘤放射治疗效果进行评价。研究结果:体外研究结果表明,金纳米颗粒dAuNPs-FA和dAuNPs均能与过氧化氢预处理后的牛血清白蛋白BSA发生交联。细胞实验发现dAuNPs和dAuNPs-FA具有很小的细胞毒性和良好的生物相容性,dAuNPs在过氧化氢预处理过得4T1细胞中表现出明显的摄取与长滞留。进一步引入叶酸后,dAuNPs-FA被肿瘤细胞摄取得更多。在同等X射线照射下,发生了蛋白质次磺酸交联的dAuNPs-FA对细胞有较大的损伤作用。小鼠体内研究发现,金纳米探针dAuNPs-FA在活体肿瘤内有明显的高摄取和长滞留,显著提高了肿瘤的CT成像和放疗增敏效果,并且对远端肿瘤转移也有一定的抑制作用。结论:该蛋白质次磺酸反应型肿瘤靶向金纳米探针dAuNPs-FA在肿瘤微环境H2O2的介导下,存在明显高的肿瘤积聚与长滞留,能够有效提高实体肿瘤的CT成像和放射治疗效果,为实现肿瘤的高效放射治疗提供了新方案。