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非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)被认为是代谢综合征(metabolicsyndrome,MS)的肝脏表现,是最常见的一种慢性肝病。作为全球最常见的慢性代谢性疾病之一——2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM),与NAFLD关系密切。研究表明,在我国,这2种疾病存在双向关系。二者之所以在临床上关系密切,与其存在共同的发病机制息息相关。随着研究的逐渐深入,炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、C反应蛋白(C reactive protein,CRP)在其中所起作用有目共睹。二甲双胍不仅是“中国2型糖尿病防治指南”中治疗T2DM的一线用药,它对于NAFLD也有一定的治疗作用。本文旨在研究炎症因子在T2DM合并NAFLD大鼠中的表达,及给予二甲双胍干预后的改变,探讨炎症因子在T2DM合并NAFLD中的作用机制及二甲双胍对于T2DM合并NAFLD大鼠的保护作用。目的1.研究T2DM合并NAFLD大鼠模型胰岛素抵抗、肝功能损害、血脂异常情况、肝脏病变情况及TNF-α、IL-6、CRP的表达情况;2.研究二甲双胍干预后,T2DM合并NAFLD大鼠模型中,上述指标的改变;3.分析TNF-α、IL-6及CRP在T2DM合并NAFLD中的作用机制及二甲双胍对于T2DM合并NAFLD大鼠的保护作用。方法建立4组大鼠模型:①空白对照组(A组);②T2DM组(B组);③T2DM+NAFLD组(C组);④T2DM+NAFLD+二甲双胍组(D组)。造模后,称量大鼠体重,收集大鼠血清及肝脏标本,称量大鼠肝脏湿重。应用生化分析仪检测下述生化指标,比较差异:谷氨酰基转移酶(glutenyl transpeptidase,GGT)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspertate aminotransferase,AST)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、空腹血糖、CRP 及甘油二酯(triglyceride,TG)。ELISA法检测:空腹胰岛素、TNF-α及IL-6。根据上述指标结果,计算:肝指数(liver index,LI)、稳态模型评估胰岛素抵抗指数(homeostasis model of assessment for insulin resistance index,HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)。对肝组织分别进行油红O染色、Masson染色、HE染色及网状纤维染色,而后根据HE染色的结果分别进行肝脏脂肪含量计分以及NAFLD活动度评分(NAFLD activity scores,NAS),评估肝内脂质聚集及肝脏脂肪性炎症程度。根据油红O染色的结果,进一步判断肝内是否存在脂肪聚集及聚集程度。根据Masson染色及网状纤维染色结果,评估纤维化改变情况。应用免疫组化法,检测肝组织内TNF-α、IL-6及CRP蛋白表达情况。结果1.T2DM组及T2DM+NAFLD组大鼠肝指数明显高于对照组,单纯T2DM组及二甲双胍干预组肝指数低于T2DM+NAFLD组(P均<0.01)。2.T2DM组及T2DM+NAFLD组大鼠胰岛素抵抗情况较对照组明显,T2DM+NAFLD组大鼠胰岛素抵抗情况较单纯T2DM组明显,T2DM+NAFLD+二甲双胍组大鼠胰岛素抵抗情况较T2DM+NAFLD组改善。其中,HOMA-IR值B、C组高于A组,B组及D组低于C组(P均<0.01);ISI值B、C组明显低于A组,B组及D组高于C组(P均<0.05)。3.与对照组相比较,T2DM组及T2DM+NAFLD组,均存在明显的肝损伤及血脂异常,且T2DM+NAFLD组肝损伤及血脂异常程度明显较单纯T2DM组及T2DM+NAFLD+二甲双胍组重。其中,B、C组大鼠血清ALT、AST、GGT、TG、TC、LDL-C水平显著高于A组,B组及D组低于C组(P均<0.01);各组HDL-C水平比较,B、C组显著低于A组(P<0.01),B组及D组较C组无明显差别(P>0.05)。4.T2DM 组血清 TNF-α、IL-6 及 CRP 水平分别为(3.28± 1.1())ng/ml、(4.29±0.48)ng/l、(3.12± 1.04)mg/1,均高于对照组(其中CRP水平与A组比,P<0.05,其余 P 均<0.01);T2DM+NAFLD 组大鼠血清 TNF-α、IL-6 及 CRP 水平分别为(12.36±2.78)ng/ml、(10.34±2.1)ng/l、(3.64±0.94)mg/1,均明显高于对照组(P均<0.01),二甲双胍干预组上述炎症因子水平分别为(2.11±0.98)ng/ml、(2.67±0.92)ng/l、(2.36± 0.67)mg/l,均低于 T2DM+NAFLD组(P 均<0.01);单纯 T2DM 组 TNF-α及 IL-6 均低于 T2DM+NAFLD 组(P<0.01),CRP与T2DM+NAFLD组无差异(P>0.05)。对免疫组化结果进行化学半定性分析,TNF-α、IL-6及CRP蛋白在T2DM组及T2DM+NAFLD组均呈高表达,二甲双胍干预组上述炎症因子蛋白表达水平低于T2DM+NAFLD组(P均<0.01),单纯 T2DM 组 TNF-α及 IL-6 低于 T2DM+NAFLD 组(P 均<0.01),CRP与T2DM+NAFLD组无明显差异(P>0.05)。5.通过肝组织HE染色、油红0染色及NAS评分、肝脏脂肪含量计分分析,T2DM组肝脂肪变程度及炎性活动度较对照组无明显差异(P均>0.05),T2DM+NAFLD组肝脏脂肪变程度及炎性活动度均高于对照组及单纯T2DM组(P均<0.01),二甲双胍干预组上述病变程度低于T2DM+NAFLD组(P均<0.01)。6.通过Masson染色及网状纤维染色,T2DM组肝纤维化改变程度较对照组无明显差异(P>0.05),T2DM+NAFLD组肝脏纤维化改变程度高于对照组及单纯T2DM组(P<0.01),二甲双胍干预组上述病变程度低于T2DM+NAFLD组(P<0.01)。结论1.炎症因子TNF-α、IL-6及CRP在T2DM合并NAFLD大鼠中呈高表达。2.二甲双胍具有改善T2DM合并NAFLD大鼠的胰岛素抵抗、血脂异常、肝功异常、慢性炎症及肝脏纤维化的作用,其机制可能与降低炎症因子的表达、改善慢性炎症状态有关。