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研究背景:急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一种常见的心血管事件,由AMI所导致的心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)性疾病的致残率和病死率逐年增加。另外,随着心脏介入治疗技术和外科手术的不断创新和普及应用,其治疗后引起的MIRI也不容忽视。MIRI性疾病已经成为临床工作中的常见病和多发病,可引起心肌细胞超微结构改变、代谢功能障碍以及细胞凋亡,影响心肌功能、代谢及心脏电生理,严重可诱发心梗。因此。预防和减少MIRI对减少死亡率、改善患者预后有着至关重要的作用。MIRI的发生机制复杂,多数研究表明其机制可能与氧化应激、细胞内钙超载、炎症反应、能量代谢障碍以及细胞凋亡等相关。微小核糖核酸(microRNA,miRNA,miR)是一段长度为19-25个核苷酸的小非编码RNA,是多细胞生物中一类丰富的基因调控分子,影响许多蛋白编码基因的表达。miRNA通过与靶向mRNA特异结合,抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA,对靶基因表达进行负调控。越来越多的证据表明miRNA参与调控许多基本的细胞行为如细胞分化、增殖、生长、迁移、凋亡等。研究发现,miRNA几乎参与心脏所有的病理生理过程,在心肌纤维化及血管再生等多种生理病理过程中都发挥着无可替代的调节作用,并且可能是其中重要关键性的调控因子之一。MiR-93是第一个被发现的miR-17 microRNA簇,与脊椎动物的早期进化有着密切的关系。有研究指出,miR-93表达减少可以显著改善脑缺血再灌注损伤,但关于miR-93在心肌缺血再灌注损伤中的作用的研究较少。转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2,nuclear factor NF-E2 factor 2)是调控细胞内氧化应激反应的关键转录分子,通过与抗氧化反应元件(antioxident response element,ARE)结合启动下游抗氧化靶基因的表达。研究表明,Nrf2信号通路是调节抗氧化和Ⅱ期代谢酶表达的主要途径,其对减轻脑组织缺血再灌注损伤具有保护作用,由此推测,Nrf2可能在MIRI中对抗氧化应激过程中发挥着重要作用。目前,Nrf2是心血管疾病的预防和治疗中一个非常具有潜力的研究热点。因此,本课题通过构建体外培养大鼠心肌细胞氧糖剥夺/复氧(OGD/R)心肌细胞模型,在分子水平上研究和探讨miR-93如何靶向调控Nrf2信号通路对OGD/R心肌细胞凋亡的机制;并在MIRI大鼠模型中探究并验证miR-93的表达及可能的机制。本课题包含以下两个部分:第一部分,miR-93在心肌细胞OGD/R模型中的表达及调控OGD/R心肌细胞模型细胞凋亡的作用机制;第二部分,在动物体内,验证miR-93在MIRI大鼠心肌组织中的表达及可能的机制。第一部分miR-93介导Nrf2信号通路在OGD心肌细胞中的作用目的:建立心肌细胞氧糖剥夺模型,分析miR-93在心肌细胞中的作用及机制。方法:(1)原代培养新生SD大鼠心肌细胞,细胞培养至第5d。(2)光学显微镜下观察心肌细胞的形态,采用免疫荧光法鉴定心肌细胞的纯度。(3)造模和分组:更换无糖培养基,将细胞置入三气培养箱(0.5%O2,5%CO2,94.5%N2)中氧糖剥夺培养,模拟体内心肌缺血损伤。实验分组依据氧糖剥夺时间分为①正常对照组(NC组),②OGD/R 1h组,③OGD/R 2h组,④OGD/R3h 组。(4)透射电镜观察各组心肌细胞的形态。(5)台盼蓝染色法测定各组心肌细胞存活率。(6)测定各组细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK-MB)和心肌肌钙蛋白(cTnI)的活性;(7)采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组心肌细胞中miR-93的表达。(8)采用TargetScan、miRDB靶基因预测软件,应用生物信息学综合分析推测Nrf2可能是miR-93靶基因,并采用双荧光素酶报告基因验证miR-93及Nrf2基因之间的靶向关系。(9)以OGD/R2h组细胞为基础,进行后续实验。NC组和OGD/R组心肌细胞分别转染miR-93 antagomir和NC-antagomir,RT-qPCR检测各转染组中miR-93和Nrf2基因的表达。(10)流式细胞术检测各转染组心肌细胞凋亡率。(11)Western blot检测各转染组心肌细胞表达蛋白Nrf2、caspase-3、cleaved caspase-3的相对含量。结果:(1)免疫荧光观察结果显示原代心肌细胞的纯度为90%以上,可以进行构建OGD/R模型。(2)透射电镜观察结果显示,OGD/R1h组的细胞中线粒体肿胀程度较轻,可观察到清晰嵴结构;OGD/R2h组的细胞中线粒体明显肿胀,部分空泡发生变性,嵴出现断裂但是程度较轻,基质内有可见透光区,肌浆网可见扩张,肌丝无序排列;OGD/R3h组的心肌细胞可见胞膜有明显破裂,贴壁脱离生长,线粒体可见严重肿胀现象,部分细胞膜可见破裂,并肌丝伴有溶解现象。(3)台盼蓝染色结果显示OGD/R各组心肌细胞的存活率显著低于NC组心肌细胞的存活率,同时随氧糖剥夺时间的延长,细胞存活率下降。(4)OGD/R各组心肌细胞的LDH、CK-MB和cTnI活性显著高于NC组心肌细胞(P<0.05),且氧糖剥夺时间越长,LDH、CK-MB和cTnI活性升高越显著。(5)RT-PCR检测各组心肌细胞中miR-93的表达水平,结果显示,与NC组比,OGD/R各组心肌细胞中miR-93的表达水平显著升高(P<0.05),且随着氧糖剥夺时间的增加,miR-93的表达水平也逐渐升高(P<0.05)。(6)TargetScan和miRDB靶基因预测软件分析Nrf2可能是miR-93的靶基因之一,双荧光素酶报告基因检测结果也证实Nrf2是miR-93靶基因。(7)在OGD/R细胞中,miR-93 antagomir组中miR-93的表达水平显著低于NC-antagomir组,而Nrf2 mRNA和蛋白的表达水平均明显高于NC-antagomir组。提示在OGD/R细胞中,miR-93能够负向调控Nrf2基因的mRNA和蛋白的表达。(8)在OGD/R细胞中,miR-93 antagomir组中细胞凋亡率明显低于NC-antagomir组,同时western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3蛋白的表达水平也发现,miR-93 antagomir组细胞中cleaved caspase-3蛋白的相对表达量明显低于NC-antagomir组,提示抑制miR-93能够显著抑制OGD/R心肌细胞的凋亡。结论:(1)体外培养成功构建OGD/R心肌细胞模型,且选取氧糖剥夺2h且复氧复糖6h的细胞模型为较适宜的OGD/R心肌细胞模型,为后续实验奠定基础。(2)miR-93在OGD/R心肌细胞中的表达水平显著升高。(3)生物信息学软件预测及双荧光素酶报告基因实验验证Nrf2是miR-93的靶基因,且miR-93能够负向调控Nrf2的表达。(4)miR-93参与调控心肌细胞凋亡,抑制miR-93减少OGD/R心肌细胞的凋亡。(5)在OGD/R细胞中,miR-93可能是通过靶向调控Nrf2信号通路,从而调控OGD/R心肌细胞的凋亡。第二部分miR-93在MIRI大鼠模型中的表达及作用目的:检测miR-93在MIRI大鼠模型中的表达并分析其作用。方法:(1)动物分组处理:将40只SD大鼠随机分为4组,每组10只:①假手术(Sham)组,②缺血再灌注模型(MIRI)组,③miR-93 antagomir组,④NC-antagomir组。构建MIRI模型前,假手术组及MIRI组大鼠尾静脉注射生理盐水0.5ml,miR-93 antagomir组和NC-antagomir组大鼠分别尾静脉注射miR-93 antagomir和antagomir阴性对照物,终浓度为80mg/kg,每天一次,共注射7d。最后一次尾静脉注射结束2h后,构建MIRI大鼠模型。(2)采用试剂盒检测大鼠动脉血中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性,采用双抗体夹心法测定大鼠血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)的水平。(3)再灌注结束24h,将心肌组织(缺血区)进行HE染色,光学显微镜线观察心肌组织的病理学变化。(4)再灌注结束24h,采用TTC染色测定心肌梗死面。(5)RT-qPCR实验检测各组大鼠心肌组织中miR-93及其靶基因Nrf2 mRNA的表达情况,western blot实验检测Nrf2及凋亡相关蛋白caspase-3,caspase-3、cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax 的表达情况。(6)检测各组大鼠心肌组织中氧化应激指标水平:超氧化物歧化酶(SOD)的活性、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。(7)采用末端脱氧核苷酸转移酶UTP缺口标记(TUNEL)法检测各组心肌组织中细胞的凋亡情况。结果:(1)miR-93在MIRI组中大鼠心肌组织中高表达,而miR-93 antagomir组中miR-93的相对表达量显著低于MIRI组和NC-antagomir组。MIRI组大鼠心肌组织中Nrf2 mRNA和蛋白的表达水平明显低于假手术组(P<0.05);而miR-93 antagomir组中Nrf2 mRNA和蛋白的相对表达量显著高于MIRI组和NC-antagomir组(P<0.05)。提示在MIRI心肌组织中miR-93的表达水平升高,而Nrf2的表达水平下降,且miR-93的表达与Nrf2呈负相关。(2)HE染色结果显示,MERI组大鼠部分心肌损伤明显,心肌组织出现坏死及炎性细胞浸润,细胞水肿,排列紊乱;miR-93 antagomir组中大鼠心肌组织损伤较MIRI组轻,炎性细胞浸润程度减轻,轻度水肿,坏死的心肌细胞较少。(3)TTC染色显示,Sham组大鼠没有心肌梗死区域,而MIRI组及NC-antagomir组中大鼠的心肌梗死面积显著高于假手术组,而miR-93 antagomir组中大鼠的心肌梗死面积显著低于NC-antagomir组(P<0.05)。(4)MIRI组大鼠血清中CK-MB和LDH活性以及cTnI的水平明显高于Sham 组(P<0.05),而与 NC-antagomir 组无显著性差异。miR-93 antagomir 组大鼠血清中CK-MB和LDH活性以及cTnI的水平明显低于MIRI组和NC-antagomir组(P<0.05)。提示抑制miR-93的表达能够降低大鼠心肌损伤的程度。(5)氧化应激指标检测结果显示,与Sham组比,MIIRI组大鼠心肌组织中MDA水平增加,SOD和GSH-Px活力下降。与MIRI组和NC-antagomir组相比,miR-93 antagomir组大鼠心肌组织中MDA的水平降低,而SOD和GSH-Px的活力则明显升高(P<0.05)。提示抑制miR-93能够抑制大鼠心肌组织的氧化应激反应。(6)TUNEL检测心肌组织细胞凋亡结果显示,Sham组中凋亡细胞极少,而在MIRI组大鼠心肌组织细胞凋亡指数明显升高(P<0.05)。而miR-93 antagomir组大鼠心肌组织的凋亡指数明显低于NC-antagomir组(P<0.05)。(7)Western blot检测结果显示,MIRI组大鼠心肌组织中Caspase-3,cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),Bcl-2蛋白的表达水平明显降低;而 miR-93 antagomir 组大鼠心肌组织中 Caspase-3,cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平明显低于NC-antagomir组和MIRI组,而Bcl-2蛋白表达水平高于NC-antagomir组和MIRI组(P<0.05)。该结果表明,抑制miR-93能够抑制心肌细胞的凋亡。结论:(1)miR-93在MIRI组心肌组织中高表达,而Nrf2在MIRI心肌组织中低表达,两者呈负相关。(2)抑制miR-93能够降低MIRI大鼠心肌组织中的氧化应激反应,减少缺血再灌注损伤。(3)在MIRI大鼠模型中,抑制miR-93的表达能够抑制心肌细胞的凋亡,减轻心肌缺血再灌注损伤,其机制可能与miR-93负向调控Nrf2信号通路有关。