何首乌为蓼科植物何首乌(Polygonum Multiflorum Thunb)的干燥块根。性微温,味苦、甘、涩。《中国药典》2005年版一部记载具有润肠通便之功效。夜交藤( Caulis Ploygoni Multiflori,YJT),又名首乌藤,为蓼科植物何首乌的干燥藤茎或带叶藤茎,性甘微苦、平,有养心、安神、通络、祛风止痛等功效,用于治疗失眠、劳伤、多汗、血虚身痛。何首乌与夜交藤虽为同一植物的不同部位,但功效却不尽相同。中药化学成分的多样性与复杂性是其发挥疗效的物质基础,因此对中药材中有效成分进行含量测定对有效控制药材质量具有非常重要的意义。一、何首乌、制首乌与夜交藤中二苯乙烯苷的含量测定二苯乙烯苷(Stilbene Glycoside)类化合物是何首乌中一类具有显著药理活性的水溶性成分,其代表成分二苯乙烯苷(2,3,5,4′-羟基二苯乙烯-2-О-β-D葡萄糖苷)具有显著的降脂作用,《中国药典》2005版采用二苯乙烯苷作为何首乌质量的评价指标,规定药用何首乌中二苯乙烯苷含量不少于1%。本实验采用RP-HPLC法分别测定了何首乌和夜交藤中二苯乙烯苷的含量,并且对药材中二苯乙烯苷的含量进行比较,为探讨何首乌和夜交藤药材药效物质基础与作用机制,开发新的药物制剂提供了依据。目的:建立测定何首乌、制首乌与夜交藤中二苯乙烯苷含量的方法,并且对不同产地3种药材中二苯乙烯苷含量进行比较。方法:(1)提取:比较了不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择目标成分提取完全的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱及检测器,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合含量测定的要求。(3)标准曲线的绘制:配制一系列浓度的二苯乙烯苷对照品溶液,测定峰面积;以二苯乙烯苷的浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,制备标准曲线。(4)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察二苯乙烯苷的分离度和理论板数。(5)专属性试验:精密吸取空白溶剂、供试品溶液及对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录20min内的色谱图。(6)精密度试验:取同一份对照品溶液,重复进样5次,记录峰面积,计算二苯乙烯苷的峰面积RSD值。(7)重复性试验:取同一批药材细粉6份,按选定方法平行制备供试品溶液,进样,测定二苯乙烯苷的质量分数,计算RSD值。(8)稳定性试验:取同一份样品溶液分别于0,2,4,6,8,10,12,24,48h进样,测定二苯乙烯苷的峰面积,计算RSD值。(9)回收率试验:取何首乌药材细粉6份,每份约0.1g,精密称定,精密加入二苯乙烯苷对照品溶液6.0mL,按选定的供试品溶液制备方法制备供试品溶液,测定峰面积,计算平均回收率。(10)检测限的确定:将二苯乙烯苷对照品溶液逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为检测限。(11)有效成分二苯乙烯苷含量的测定:分别取不同产地何首乌、制首乌与夜交藤药材各17批,制备供试品溶液,按选定的色谱条件进行含量测定。结果:(1)提取:最佳提取条件为取药材细粉,用50%乙醇超声提取30min。(2)色谱条件:色谱柱为C18柱;流动相:甲醇-乙腈-1%甲酸(15:10:75),检测波长为320nm,柱温30℃,流速1.0mL/min。(3)标准曲线的绘制:结果表明二苯乙烯苷在20.0~160.0μg/mL与峰面积呈良好的线性关系,回归方程:Y =7.17×107X-1.00×105,r=0.9996(n=6)。(4)系统适用性试验:理论板数按二苯乙烯苷峰计算不低于2500,分离度大于1.5。(5)专属性试验:空白溶剂(50%乙醇)对测定无干扰。(6)精密度试验:取二苯乙烯苷对照品溶液连续进样5次,测定其峰面积,RSD值为1.19%,测定的峰面积RSD值结果表明,该法精密度良好。(7)重复性试验:取同一批药材细粉6份,精密称定,按供试液制备方法处理,6份供试液分别进样,测定二苯乙烯苷的质量分数,RSD值为1.30%。表明这种方法重复性良好。(8)稳定性试验:取供试品溶液,于0、2、4、6、8、10、12、24、48h测定二苯乙烯苷的峰面积,RSD值为1.26%。结果表明,供试品溶液在48h以内稳定。(9)回收率试验:计算平均回收率为99.13% (RSD=0.78%,n=6)(10)检测限的确定:检测限为1.6ng。(11)有效成分二苯乙烯苷含量的测定:测定结果显示何首乌、制首乌和夜交藤中二苯乙烯苷含量分别在1.956%~3.364%、1.891%~3.504%、0.011%~0.252%之间。结论:本文首次建立了高效液相色谱法测定夜交藤中二苯乙烯苷含量的方法。本法简便快速,回收率及线性关系良好,适合于何首乌、制首乌与夜交藤中二苯乙烯苷的定量分析。二、何首乌、制首乌与夜交藤中蒽醌类成分的含量测定何首乌中另一类主要有效成分为蒽醌类(Anthraquinone,AQ),包括大黄素(Emodin,EM)、大黄酸(Rhein)、大黄酚(Chrysophanol,CH)、大黄素甲醚(Physcion,PH)等。夜交藤作为何首乌的地上部分,药效作用却不相同,《中国药典》2005版中记载了何首乌中二苯乙烯苷的含量测定方法,但并未记载关于何首乌中蒽醌类成分的含量测定方法,本实验采用RP-HPLC法分别测定了何首乌、制首乌与夜交藤中蒽醌类成分的含量,并且对3种药材中蒽醌类成分的含量进行比较,为探讨其药效物质基础与作用机制,开发新的药物制剂提供了依据。目的:建立测定何首乌、制首乌与夜交藤中蒽醌类成分含量的方法,并且对不同产地3种药材中蒽醌类成分含量进行比较。方法:(1)提取条件选择:比较了不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择提取蒽醌完全,操作简单的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱及检测器,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合含量测定的要求。(3)标准曲线的绘制:配制一系列浓度的大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚对照品溶液,测定峰面积;以大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,制备标准曲线。(4)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察蒽醌类成分的分离度和理论板数。(5)专属性试验:精密吸取空白溶剂、供试品溶液及对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录20min内的色谱图。(6)精密度试验:取同一份蒽醌类对照品溶液,重复进样5次,记录峰面积,按蒽醌类对照品测定的峰面积计算RSD值。(7)重复性试验:取同一批药材细粉6份,按选定方法平行制备供试品溶液,进样,测定蒽醌的质量分数,计算RSD值。(8)稳定性试验:取同一份样品溶液分别于0,2,4,6,8,10,12,24,48h进样,测定蒽醌的峰面积,计算RSD值。(9)回收率试验:精密称定何首乌药材细粉6份,每份约0.25g,精密加入大黄素和大黄素甲醚对照品溶液适量,按选定方法制备供试品溶液,测定峰面积,计算平均回收率。(10)检测限的确定:将4种蒽醌类对照品溶液分别逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为检测限。(11)蒽醌类有效成分含量的测定:分别取不同产地何首乌、制首乌与夜交藤药材各17批,按选定的色谱条件进行含量测定。结果:(1)提取:游离型蒽醌用70%甲醇超声提取,然后用氯仿萃取得到;结合型蒽醌是将萃取后水液部分加入氯仿与硫酸水浴回流,再用氯仿萃取,取氯仿层得到。(2)色谱条件:色谱柱为C18柱;流动相:甲醇-乙腈-1%磷酸(70:10:15),检测波长为254nm,柱温30℃,流速1.0mL/min。(3)标准曲线的绘制:大黄素在0.6~90.0μg/mL和大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚在0.5~100.0μg/mL与峰面积呈良好的线性关系,标准曲线分别为:Y大黄素= 53470X– 36480,r=0.9991(n=6);Y大黄酸= 86420X–150360,r=0.9993(n=6);Y大黄酚= 148295X–70207,r=0.9997(n=6);Y大黄素甲醚= 35061X–38742,r=0.9996(n=6)。(4)系统适用性试验:理论板数分别按大黄素计算不低于2500,分离度大于1.5。(5)专属性试验:空白溶剂(甲醇)对测定无干扰。(6)精密度试验:分别取大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚对照品溶液连续进样5次,测定其峰面积,RSD值分别为0.591%、1.035%、0.771 %和1.352 %。,测定的峰面积RSD值,结果表明,该方法精密度良好。(7)重复性试验:取同一批药材细粉6份,精密称定,按供试品液制备方法处理,连续进样6次,测定大黄素和大黄素甲醚的质量分数, RSD值分别为0.153%和2.976%。表明该方法重复性良好。(8)稳定性试验:取供试品溶液,于0、2、4、6、8、10、12、24、48h测定大黄素和大黄素甲醚的峰面积,RSD值分别为2.656%和1.487%。结果表明,供试品溶液在48h以内稳定。(9)回收率试验:平均回收率分别为大黄素:99.75 %(RSD= 0.489%,n=6)和大黄素甲醚:99.02 %(RSD =0.969 %,n=6)。(10)检测限的确定:大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚的检测限分别为1.5ng、2.5ng、1.6ng和4.0ng。(11)有效成分含量的测定:测定结果显示何首乌、制首乌与夜交藤中游离型大黄素与大黄素甲醚的含量分别在0.08%~0.041%和0.013%~0.101%、0.036%~0.067%和0.012%~0.068%、0.005%~0.013%和0.005%~0.015%之间。结合型大黄素与大黄素甲醚的含量分别为0.009%~0.019%和0.006%~0.049%、0.011%~0.025%和0.002%~0.020%、0.002%~0.006%和0.004%~0.011%之间。结论:本文首次建立了高效液相色谱法测定何首乌、制首乌与夜交藤中游离与结合蒽醌含量的方法。该法简便快速、结果准确可靠,专属性强,精密度和稳定性良好,可用于何首乌、制首乌与夜交藤中游离与结合蒽醌的含量测定,从而对何首乌、制首乌与夜交藤药材进行质量控制。中药作为多组分复杂体系,其化学成分众多,加上药材品种、产地、加工、贮藏等因素的影响,其质量控制一直是中药分析的重点和难点。中药药效一般是多种化学成分共同作用产生的结果,但是大多数中药的有效成分及药理作用机制尚未明确。目前中药质量控制的方法只对其中少数已知成分进行分析,无法体现中医药的整体性特点,因此必须发展中药质控的新方法,建立中药的现代质控标准体系。中药指纹图谱分析技术是使用多学科交叉、综合技术手段对物质组成体系的质量稳定性进行评价的方法,他通过谱图反应中药材内的化学成分种类与数量,能够提供综合信息从而较好的评价药材质量。一、何首乌、制首乌指纹图谱研究何首乌作为常用药物,其质量控制仅是凭借对单一的二苯乙烯苷和蒽醌的含量测定还显得不足,制首乌作为何首乌的炮制品其质量更是存在较大差异,实验研究表明,指纹图谱能够很好的对何首乌与制首乌药材进行全面的质量评价。目的:建立不同产地何首乌与制首乌药材HPLC指纹图谱,得到对照图谱并对不同产地的指纹图谱进行比较,为全面控制何首乌与制首乌药材质量提供新的依据。方法:(1)提取:比较不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取效率高,峰型较好的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱及检测器参数,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中大黄素峰的分离度和理论板数。(4)专属性试验:精密吸取空白溶剂、供试品溶液及对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录80min内的色谱图。(5)精密度试验:取同一份供试品溶液,重复进样6次,比较所得指纹图谱的相似度。(6)重复性试验:分别取同一批何首乌和制首乌6份,平行制备供试品溶液,进样,比较所得指纹图谱的相似度。(7)稳定性试验:取供试品溶液分别于0,2,4,6,8,10,12,24,36,48h进样,比较所得指纹图谱的相似度。(8)指纹图谱的建立:分别取不同产地的何首乌和制首乌药材各19批和一批对照药材制备供试品溶液,进行指纹图谱分析。结果:(1)提取:药材粉末用甲醇超声提取30min。(2)色谱条件:色谱柱:C18柱(250mm×4.6mm,5μm);乙腈(A)-0.1%磷酸(B)为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0mL/min,柱温为30?C,二极管阵列检测器(DAD),进样量20μl。(3)系统适用性试验:按大黄素峰计算理论板数约为2500,与其它色谱峰的分离度大于1.5。(4)专属性试验:空白溶剂(甲醇)对测定无干扰,二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚对照峰分别与供试品溶液图谱的S1(17号峰)号峰(28.6min)、S2(16号峰)号峰(55.6min)和S3(19号峰)号峰(63.5min)相对应。(5)精密度试验:相似度均高于0.90,符合指纹图谱测定要求,精密度良好。(6)重复性试验:相似度均高于0.90,符合指纹图谱测定要求,重复性良好。(7)稳定性试验:相似度均高于0.90,结果表明,供试品溶液在48h以内稳定。(8)指纹图谱的建立:得到20批何首乌药材,生成对照指纹图谱,同时得到不同产地制首乌药材的指纹图谱。(9)数据分析:利用2004A版相似度软件进行分析,结果何首乌与制首乌相似度分别在在0.874~0.992与0.667~0.995之间。结论:本文建立了何首乌和制首乌药材HPLC指纹图谱,获得其对照图谱,并与不同产地的何首乌和制首乌药材进行比较,利用相似度分析对不同产地药材间的差异进行了研究,对其质量进行了综合评价,有助于何首乌药材的标准化种植和质量控制。二、夜交藤指纹图谱研究夜交藤作为镇静、降脂类药物,还没有统一的标准来进行质量控制。本文首次采用HPLC-DAD法建立了夜交藤药材的指纹图谱,得到对照指纹图谱,并建立其共有模式。目的:建立不同产地夜交藤药材HPLC指纹图谱,得到对照图谱并对不同产地的指纹图谱进行比较,为全面控制夜交藤药材质量提供新的依据。方法:(1)提取:比较不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率高,所得色谱图较好的提取条件。(2)色谱条件:选用合适的色谱柱及检测器参数,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,使色谱图符合指纹图谱研究要求。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中大黄素峰的分离度和理论板数。(4)专属性试验:精密吸取空白溶剂、供试品溶液及对照品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录110min内的色谱图。(5)精密度试验:取同一份夜交藤供试品溶液,重复进样6次,比较所得指纹图谱的相似度。(6)重复性试验:分别取同一批夜交藤药材6份,平行制备供试品溶液,进样,比较所得指纹图谱的相似度。(7)稳定性试验:取供试品溶液分别于0,2,4,6,8,10,12,24,48h进样,比较所得指纹图谱的相似度。(8)指纹图谱的建立:分别取不同产地的夜交藤药材19批,制备供试品溶液,进行指纹图谱分析。结果:(1)提取:药材粉末用乙酸乙酯超声提取30min。(2)色谱条件:色谱柱:C18柱(250mm×4.6mm,5μm);乙腈(A)-0.1%磷酸(B)为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0mL/min,柱温为30 ?C,二极管阵列检测器(DAD),进样量20μl。(3)系统适用性试验:按大黄素峰计算理论板数约为2500,与其它色谱峰的分离度大于1.5。(4)专属性试验:空白溶剂(甲醇)对测定无干扰,二苯乙烯苷、大黄素和大黄素甲醚对照峰分别与供试品溶液图谱的S1(4号峰)号峰(19.98min)、S2(13号峰)号峰(82.73min)和S3(15号峰)号峰(91.95min)相对应。(5)精密度试验:相似度均高于0.90,符合指纹图谱测定要求,精密度良好。(6)重复性试验:相似度均高于0.90,符合指纹图谱测定要求,重复性良好。(7)稳定性试验:相似度均高于0.90,结果表明,供试品溶液在48h以内稳定。(8)指纹图谱的建立:得到19批夜交藤药材的指纹图谱并且生成对照指纹图谱。(9)数据分析:利用2004A版相似度软件进行分析,结果相似度在0.67~0.99之间。结论:本文首次建立了夜交藤药材HPLC指纹图谱,获得其对照图谱,并对不同产地的夜交藤药材进行比较,利用相似度分析对不同产地药材间的差异进行了研究,对其质量进行了综合评价,有助于夜交藤药材的质量控制。