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癌症的一个共同特征是细胞代谢的适应,以满足其异常的生长、生存和增殖的需求,这就是Warburg效应,其特征在于其代谢途径中过度活跃的有氧糖酵解。针对整个糖酵解途径中存在的同工酶的差异表达是肿瘤靶向治疗中最有吸引力的一种方法,其中研究最多的是丙酮酸激酶M的异构体。但丙酮酸激酶M(Pyruvate kinase M)不同表型在肿瘤生长中的重要性存在很大争议。在此,我们开展了联合敲低丙酮酸激酶M1和丙酮酸激酶M2在其高表达的三阴性乳腺癌细胞系中的相关研究,并探索了它们在三阴性乳腺癌细胞系中的可能作用,这为三阴性乳腺癌的诊断和治疗提供新的理论依据。方法1.验证PKM在TNBC组织及细胞系中的表达:(1)免疫组织化学实验分析15对TNBC组织及其癌旁正常组织中PKM的蛋白表达水平。(2)Western blot、RT-PCR实验分析PKM在TNBC细胞系中的的表达水平。2.检测PKM在TNBC发展中的重要意义:(1)Western blot、RT-PCR实验分析慢病毒稳定转染细胞株中的PKM的敲低效率。(2)MTT、克隆形成实验检测敲低PKM对细胞生长的影响。(3)流式细胞术检测敲低PKM对细胞周期、凋亡的影响。(4)Transwell实验分析敲低PKM对细胞迁移的影响。3.分析PKM对糖代谢在TNBC及正常乳腺上皮细胞的影响:MTT法检测2-脱氧-D-葡萄糖对TNBC及正常乳腺上皮细胞实验及对照组生长的影响。4.验证PKM在肿瘤细胞中的信号调节途径:(1)通过双荧光素酶报告基因实验及Western blot分析敲低PKM对NF-κB信号通路的影响。(2)RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳分析敲低PKM对NF-κB靶向基因的调节。结果1.验证PKM在TNBC组织及细胞系中的表达:(1)PKM在TNBC组织中高表达。(2)PKM在TNBC细胞系中高表达,而在正常乳腺细胞中低表达。2.证实PKM在TNBC细胞中发展的重要意义:(1)本实验采用慢病毒构建了稳定敲低PKM的TNBC细胞系。(2)敲低PKM会显著抑制TNBC细胞的增殖。(3)敲低PKM引起细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡。(4)敲低PKM能有效抑制TNBC细胞的迁移、侵袭。3.验证了2-脱氧-D-葡萄糖对TNBC细胞增殖的抑制。2-脱氧-D-葡萄糖对TNBC细胞增殖的抑制效率高相比与正常乳腺上皮细胞。4.验证PKM对NF-κB信号通路的调节机制。(1)敲低PKM抑制NF-κB的活性通过减少p65的丝氨酸536位点的磷酸化作用。(2)敲低PKM同时抑制NF-κB靶向基因的表达。结论1.PKM在TNBC组织及细胞中高表达。2.敲低PKM抑制TNBC细胞增殖、迁移,引起细胞周期阻滞。3.TNBC细胞中敲低PKM抑制NF-κB的活性并抑制NF-κB靶向基因的表达。