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目的:构建表达超抗原SEA基因的由前列腺特异性抗原(PSA)启动子及端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子双调控的特异性增殖溶瘤腺病毒SG504-SEA。体外实验观察SEA基因的表达及其刺激淋巴细胞对肿瘤的杀伤功能,及SEA促细胞因子分泌作用。方法:从前列腺癌组织基因组DNA中获得522bp大小的PSA启动子序列,将PSA启动子克隆到由hTERT启动子调控的特异性增殖溶瘤腺病毒载体SG502中,得到靶向前列腺癌细胞的双调控溶瘤腺病毒载体SG504。将已构建好的含有771bp大小SEA基因片段的病毒骨架质粒PPE3-ccdb-SEA与SG504用Lipofectamine2000共转染至293细胞。共转染后9～14d出现病毒空斑,经过三次病毒空斑纯化,经鉴定正确的腺病毒命名为SG504-SEA,即携带SEA基因的双调控靶向前列腺癌的特异性溶瘤腺病毒。通过RT-PCR检测SEA在前列腺癌DU145细胞内不同时间段mRNA表达,分别于12、24、48h提取细胞总RNA行RT-PCR检测SEA在核酸水平的表达量;将重组病毒以5MOI的滴度感染肿瘤细胞DU145,分别于12、24、48h取出,免疫荧光定位SEA表达于前列腺癌细胞;western blot测定SEA蛋白表达;显微镜下动态观测淋巴细胞与前列腺癌细胞共培养,ELISA检测TNF和IL-2分泌。结果:经PCR及酶切鉴定,SEA基因成功克隆到病毒载体中,可以表达SEA基因,且病毒滴度为2.0×1010pfu/ml。RT-PCR检测SG504-SEA在肿瘤细胞内不同时段mRNA的表达,琼脂糖电泳252bp处可见清晰条带,转染前列腺癌DU145细胞在12、24、48小时持续表达SEA mRNA;免疫荧光定位DU145细胞表面可以看到明显的荧光表达,可以确定SEA基因表达于前列腺肿瘤的细胞膜上,并且不同时段细胞表达荧光的亮度存在差别,随着时间增加荧光表达逐渐增强;SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色显示在27kDa附近可看到明显条带,而未转染细胞不存在。Western-blot结果证实SEA蛋白的表达成功;淋巴细胞与肿瘤细胞共培养12、24、48h实验组肿瘤细胞明显少于对照组,表明DU145细胞与淋巴细胞共同培养的过程中,转染SEA基因的肿瘤细胞相对未转染的细胞更易被淋巴细胞捕获杀伤,对淋巴细胞有一定的趋化作用;ELISA检测TNF和IL-2分泌量实验组均高于对照组。结论:成功构建了表达超抗原SEA基因的双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG504-SEA。证明其具有体外刺激淋巴细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用,对肿瘤细胞周围的细胞因子分泌存在促进作用。