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N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶V(N-acetylglucosaminyltransferase V,GnT-V)是分布在高尔基体中的一种重要的N-糖链加工酶,它以UDP-GlcNAc为供体,催化七糖二天线阶段或八糖三天线阶段的N-糖链形成三天线及四天线N-糖链。GnT-V与肿瘤的发生和转移相关,其产物GlcNAcβ1,6Manα1,6结构与多种癌细胞的转移潜力有关。本室研究发现,GnT-V表达受阻增加了人肝癌SMMC7721细胞对全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)诱导的凋亡的敏感性,但机制尚不明确。此外,我们还发现内质网应激发生于GnT-V表达受阻的SMMC7721细胞。在本论文中,我们进一步探讨了ATRA诱导GnT-V表达受阻的SMMC7721细胞发生凋亡的机制,并将其与内质网应激联系起来。 在前期的研究中我们发现GnT-V反义cDNA稳定转染的SMMC7721细胞(GnT-V-AS/7721)中存在持续的慢性的内质网应激。从本论文的第一部结果我们得出结论:ATRA通过加剧GnT-V-AS/7721细胞中的内质网应激诱导细胞凋亡。在80μMATRA处理24小时的GnT-V-AS/7721细胞中,我们发现内质网应激标志性分子GRP78/Bip(glucose regulated protein 78/immunoglobulin chain binding protein)、CHOP(C/EBP homologus protein)及剪接后XBP1(X box binding protein 1)的表达上调,这些结果都说明ATRA加剧了本来存在于GnT-V-AS/7721细胞中的内质网应激。此外,ATRA处理的GnT-V-AS/7721细胞中还发现了caspase-12、-9和-3的剪切激活以及凋亡形态学变化,说明ATRA诱导了细胞凋亡。以上的所有结果表明,ATRA通过加剧GnT-V-AS/7721细胞中的内质网应激诱导细胞凋亡。这为我们提供了一个ATRA诱导肝癌细胞发生凋亡的新机制。进一步的研究结果发现,80μMATRA显著抑制GnT-V-AS/7721细胞中GnT-V的表达,这可能是ATRA加剧GnT-V-AS/7721细胞中内质网应激的机制之一。 在论文的第二部分,我们在80μMATRA处理的GnT-V-AS/7721细胞中检测到GRP78/Bip、CHOP、剪切后ATF6(activating transcription factor 6)蛋白及XBP1mRNA剪接产物的上调,caspase-3、PARP[Poly(ADP-ribose)polymerase]也发生了剪切,这再次证明ATRA加剧了GnT-V-AS/7721细胞中的内质网应激并诱导细胞凋亡的结论。更重要的是,我们发现ATRA抑制了GnT-V-AS/7721细胞中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代谢酶CBS(cystathionine-β-synthase)和BHMT(betaine-homocysteine methyltransferase)的表达,增加了细胞内Hcy浓度,并降低了细胞内GSH(glutathione)水平。为了观察ATRA对细胞Hcy代谢的作用,我们用不同浓度的外源性Hcy处理细胞。结果发现,ATRA处理使GnT-V-AS/7721细胞中的Hcy浓度快速提升到一个很高的水平,这说明ATRA干扰了GnT-V-AS/7721细胞的Hcy代谢,造成了细胞内Hcy堆积,因而增加了GnT-V-AS/7721细胞对外源性Hcy诱导的内质网应激的敏感性。同时,我们也观察到了GRP78/Bip的显著上调和XBP1mRNA的完全剪接。进一步的研究发现,在GnT-V-AS/7721细胞中,ATRA降低细胞内GSH浓度,并阻碍了外源性Hcy诱导的GSH水平的提高。所有的结果表明,ATRA通过抑制Hcy代谢关键酶CBS和BHMT的表达提高细胞内Hcy水平、降低细胞内GSH浓度,从而加剧了GnT-V-AS/7721细胞中的内质网应激并诱导细胞凋亡。值得一提的是,来源于正常肝组织的L02细胞对ATRA诱导的凋亡不敏感,ATRA对其Hcy代谢的作用也不明显。也就是说,ATRA仅特异性地诱导GnT-V表达抑制的GnT-V-AS/7721细胞发生凋亡。这为ATRA成为一个潜在的抗癌药物提供了有利的依据。 综上所述,ATRA干扰了GnT-V-AS/7721细胞的Hcy代谢,引起细胞中Hcy堆积和GSH耗竭,最终加剧了GnT-V-AS/7721细胞中的内质网应激并诱导细胞凋亡。