论文部分内容阅读
套细胞淋巴瘤（MCL）是一种罕见的成熟B细胞淋巴恶性肿瘤,病理标志为易位t（11;14）（q13,q32）,使细胞周期蛋白D1（CCND1）过度表达,最终导致细胞增殖调控紊乱。目前的治疗方案主要是抑制肿瘤的恶性增殖来延长患者的生存期,但不能从根本上改变肿瘤的特性,因此需要针对新生物途径的新治疗方法。本课题组合成的4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate（ATPR）与传统的全反式维甲酸相比,在急性髓系白血病中具有更高的溶解度和优越的分化效果。已有研究证明ATPR可诱导急性早幼粒细胞白血病的分化和增殖。然而,ATPR是否能诱导MCL细胞向正常免疫细胞分化,从未被研究过。在这项研究中,我们发现在ATPR处理后JEKO-1细胞的增殖被抑制而分化被激活。我们进一步发现神经转录因子SOX11在MCL中高表达并且被ATPR下调。在体外和体内沉默SOX11后,JEKO-1细胞的恶性增殖和抑制分化得到逆转,而SOX11的过度表达加剧了JEKO-1细胞的恶性表型。此外,E2F1蛋白作为转录因子发挥作用,通过与多种基因的启动子区域结合来增强细胞增殖,包括参与细胞周期调节活动和DNA复制的基因。Rb/E2F1通路失调通过解除对E2F转录因子家族的调节来促进肿瘤发展,从而导致不受控制的细胞周期进程。有文献表明,在细胞周期进程中,细胞周期蛋白D激活细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4/6使RB失活,允许E2F1的S期基因转录。Cyclin D1/Rb/E2F1轴参与MCL并受ATPR调节。综上所述,我们发现ATPR通过SOX11/Cyclin D1/Rb/E2F1促进JEKO-1细胞分化。本研究为未来用ATPR诱导分化治疗MCL提供了实验依据。目的:此研究旨在探究SOX11在ATPR诱导的人套细胞淋巴瘤细胞分化及其机制。方法:1.体外实验初步探讨ATPR诱导人套细胞淋巴瘤细胞分化的作用为探究人套细胞淋巴瘤细胞JEKO-1细胞株在ATPR处理后对分化的影响,我们首先采用瑞士吉姆萨染色法观察ATPR在不同浓度(10-5 M,10-6 M,10-7 M)和不同时间（0,24,48,72 h）对细胞形态变化的影响,接着采用western blot和流式细胞术检测ATPR在不同浓度(10-5 M,10-6 M,10-7 M)和不同时间（0,24,48,72 h）下对表面分化抗原CD138和CD38的影响,最后采用CCK8法筛选出不同浓度(10-5 M,10-6 M,10-7 M,10-8 M,10-9 M)ATPR对人套细胞淋巴瘤细胞的增殖抑制作用。2.体外实验探究ATPR对套细胞淋巴瘤细胞中SOX11表达的影响采用流式细胞术对来自脐带血的CD34阳性细胞进行鉴定,用western blot检测SOX11在不同细胞系的蛋白表达。设置阳性药对照实验,采用western blot和免疫荧光技术确定SOX11在细胞的分布。接着用western blot检测不同浓度(10-5 M,10-6 M,10-7 M,10-8 M,10-9 M)和不同时间（0,24,48,72 h）的ATPR对SOX11蛋白表达和m RNA水平的影响。3.体内外实验探究沉默或过表达SOX11在ATPR诱导套细胞淋巴瘤分化和周期阻滞中的作用为了研究SOX11在ATPR诱导套细胞淋巴瘤分化和周期阻滞中的作用,慢病毒沉默或过表达SOX11,western blot,q PCR和免疫荧光技术验证转染效果。免疫荧光观察沉默或过表达SOX11后细胞增殖情况,western blot检测Prb,Cyclin D3,Cyclin A2,CDK4蛋白的表达情况,瑞士吉姆萨染色观察细胞形态,western blot和流式细胞术检测沉默或过表达SOX11和ATPR处理后CD138和CD38的变化情况。流式细胞术检测细胞凋亡情况。体内构建NSG异种移植瘤小鼠模型,观察SOX11沉默后对小鼠体内肿瘤生长的影响,再用western blot和免疫组化检测小鼠肿瘤组织中的蛋白表达变化。4.体外实验进一步探讨ATPR通过SOX11/Cyclin D1/RB/E2F1信号途径来发挥作用采用western blot检测不同浓度(10-5 M,10-6 M,10-7 M,10-8 M,10-9 M)和不同时间（0,24,48,72 h）的ATPR对Cyclin D1,Prb,E2F1的蛋白表达影响,分别沉默和过表达SOX11后,观察Cyclin D1/RB/E2F1通路蛋白水平的变化。结果:1.瑞士吉姆萨染色结果显示,ATPR浓度为10-5M作用72小时对JEKO-1细胞核收缩明显,分化的效果最佳。western blot和流式细胞术表明ATPR浓度为10-5M作用72小时对JEKO-1细胞的CD138和CD38的蛋白表达增加最多和曲线右移最明显。CCK8结果也表明ATPR的最佳抑制浓度为10-5M。2.流式细胞术和western blot结果表明SOX11在人套细胞淋巴瘤细胞核中高表达,并且ATPR能抑制SOX11的表达,呈现时间和剂量依赖性。3.实验结果表明,沉默SOX11后,SOX11的荧光表达明显减弱,G0/G1期比例减少,细胞周期相关蛋白Prb,Cyclin D3,Cyclin A2,CDK4的表达量减少,而细胞表面分化抗原CD138和CD38蛋白表达量增加。瑞士吉姆萨染色结果也显示沉默SOX11后,JEKO-1细胞核收缩呈肾型,核质比降低,提示细胞分化程度高,流式细胞术结果显示细胞表面分化抗原CD138和CD38的阳性细胞数量增加,流式细胞术结果还表明沉默SOX11可以诱导细胞凋亡。以上实验结果在ATPR处理后效果均加强。而用慢病毒过表达SOX11,荧光表达明显增强,G0/G1期比例增加,细胞周期相关蛋白Prb,Cyclin D3,Cyclin A2,CDK4的表达量增加,而细胞表面分化抗原CD138和CD38蛋白表达量减少。瑞士吉姆萨染色结果也显示过表达SOX11后,细胞分化不明显,流式细胞术结果显示细胞表面分化抗原CD138和CD38的阳性细胞数量减少,流式细胞术结果还表明过表达SOX11抑制了细胞凋亡。然而以上实验结果在过表达SOX11和ATPR共同处理后与正常组差不多,提示过表达SOX11逆转了ATPR诱导套细胞淋巴瘤分化和周期阻滞中的作用。4.结果表明ATPR处理后,Cyclin D1,Prb,E2F1的蛋白表达均减少,沉默和过表达SOX11后,结果显示在ATPR处理和沉默USO1后,磷酸化的RB,E2F1,Cyclin D1蛋白表达水平都降低,过表达SOX11后则逆转了ATPR的抑制作用。结论:ATPR通过抑制SOX11的表达,进而影响了Cyclin D1/RB/E2F1通路,最终诱导人套细胞淋巴瘤细胞分化和周期阻滞。