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人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)又称人类疱疹病毒5型,在自然界普遍存在,能够引发多种疾病,也是先天性感染最为常见的病毒。HCMV感染率极高,健康成年人感染该病毒多无明显临床症状,并常以潜伏状态携带该病毒。但在免疫力低下人群中,其感染或复发常导致严重后果。不仅如此,HCMV的感染还与糖尿病、心血管系统疾病及恶性肿瘤等的发生发展密切相关。HCMV包膜糖蛋白B(glycoprotein B,gB)能诱发机体产生中和抗体,在病毒载量较高的体液中,如尿液和唾液,均可检测到HCMV gB,提示其在HCMV感染的防治及诊断中具有广阔的应用前景。HCMV pp65蛋白在整个病毒复制周期都有表达,是HCMV的主要结构蛋白,且高度保守,可以作为HCMV感染的一个重要标记物,用于快速诊断。本研究旨在针对HCMV gB和pp65的重要表位制备单克隆抗体。将gB三个中和抗原表位(antigenic domains,AD)AD-1、AD-2、AD-3的编码序列嵌合在一起组成AD13,送公司进行生物合成;以HCMV DNA为模板,采用PCR技术获取HCMVpp65优势抗原表位区(297-510aa)的编码序列。将目的片段与表达载体pET-32a连接构建重组表达载体,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过免疫印迹法(Western blotting,WB)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbence assay,ELISA)对重组蛋白进行特异性鉴定,结果显示AD13和pp65均具有良好的免疫反应性。大量表达重组蛋白,经过包涵体洗涤、目的蛋白透析复性、His-taq亲和层析和分子筛层析纯化后,重组蛋白的纯度可达99%,可用于后续试验。选取6-8周龄的BALB/C雌鼠,用纯化后的重组蛋白免疫小鼠,采用皮下多点注射免疫的策略,每只小鼠每次免疫的蛋白总量为100 μg,每隔14天进行一次皮下免疫,每次免疫前通过间接ELISA检测免疫小鼠血清中目的抗体的效价变化。四次皮下免疫后,百万倍稀释小鼠血清OD450高达1.0以上,可通过脾脏和尾静脉注射目的蛋白进行加强免疫。加强免疫后三天分离小鼠的脾脏细胞,与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过20%FBS-HAT-1640培养基筛选融合细胞。阳性克隆经过4次克隆化后,筛选获得能高效、稳定分泌抗AD13和pp65单克隆抗体的细胞株,并通过间接ELISA和WB对抗体的免疫反应性和抗体类型进行鉴定。本研究在大肠杆菌中表达出具有高活性的重组AD13和pp65蛋白,并成功地筛选到了数株相应的高活性和免疫反应性的单克隆抗体,为今后开发具有自主知识产权的HCMV疫苗及诊断试剂奠定了基础。